作者nellnell (小厚)
看板Biotech
標題[求救]transfection後細胞長不好
時間Sat Aug 13 12:09:53 2016
大家好
上一篇剛好有人問了類似的問題 不過和我的情況不盡相同
也已經爬過文了 所以就另開一篇發問
最近使用HCT116細胞transfect shRNA (plasmid) 到10cm的dish中
使用的是K2 reagent這個牌子 所有transfect的量都是按照原文protocol建議
Day0的時候放入1000000(100萬)顆細胞到dish當中
24小時後用15ug plasmid以及30ul reagent來做transfection
再過24小時之後換成complete medium
然後老師是建議我在72小時的時候收細胞這樣
但是看到有幾盤都是呈現要死不活的狀態 收下來量都不多
這一次就是GFP還有sh-control兩盤看起來最慘，很多細胞都浮起來
其他shRNA收下來的量甚至比control還多
1.這樣是不是表示我這次已經失敗(因為shcontrol量還更少)
不過我還是會跑wb看看蛋白質
2.實驗室的助理用相同條件transfect細胞都長的ok，我想不出哪邊和他不一樣
他有說可能是我的DNA有問題，但是我之前也成功transfect過長的很好的GFP
3.因為用來繼代的那盤細胞長的非常正常，我認為是transfect出了問題
不知道有哪邊有問題請大家幫忙 ><
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1F：推 tynse71864: 1.dilute用的 serum free medium有污染嗎? 08/13 12:31
2F：→ tynse71864: 2.如果transfect 24hr後才換 medium會導致死亡， 試試 08/13 12:31
3F：→ tynse71864: 看更短時間就換 (6hr之類) 08/13 12:31
4F：→ tynse71864: 另外你的細胞在 transfect後 4天才收… 他會長滿吧? ( 08/13 12:33
5F：→ tynse71864: ctrl組) 08/13 12:33
6F：→ tynse71864: 其他 knock down可能本來就長不好 所以4天後還沒長滿 08/13 12:34
7F：→ tynse71864: 才沒飄 (猜的啦) 08/13 12:34
8F：→ nellnell: serum有沒有污染要等新的來了測試才知道 目前手邊沒有 08/13 12:37
9F：→ nellnell: 那請問如果更短的時間換complete medium，建議多久呢? 08/13 12:39
10F：→ nellnell: 怕太快就換的話DNA還沒進去細胞就被我換掉了 08/13 12:39
11F：→ nellnell: HCT116根據經驗 繼代後放3-4天都是可以的 08/13 12:41
12F：推 tynse71864: 我是說 serum free的 medium喔～ 08/13 12:42
13F：→ tynse71864: 我沒用過 k2,但一般 lipo建議6小時就換 08/13 12:42
14F：推 tynse71864: 你以前送 gfp長的很好也是用一樣條件送的？ 08/13 12:44
15F：→ nellnell: 請問t大 你serum free是指哪一個步驟? 08/13 12:45
16F：→ nellnell: transfect後換的是complete medium 我應該沒記錯吧QQ 08/13 12:46
17F：→ nellnell: 是的 一樣條件 不過是不同次抽的GFP 08/13 12:47
※ 編輯: nellnell (1.160.31.104), 08/13/2016 12:48:02
18F：推 tynse71864: dilute dna跟 K2 reagent用的 medium 08/13 13:05
19F：→ nellnell: 了解 那我先試試看6小時換complete medium 謝謝~ 08/13 13:14
20F：推 tynse71864: 不同次 GFP有機率發生問題 還是要檢查看看 ? 如果 08/13 19:26
21F：→ tynse71864: tf 1天後沒事，3天後有事 可能就是上面提的原因了～ 08/13 19:26