作者nellnell (小厚)
看板Biotech
标题[求救]transfection後细胞长不好
时间Sat Aug 13 12:09:53 2016
大家好
上一篇刚好有人问了类似的问题 不过和我的情况不尽相同
也已经爬过文了 所以就另开一篇发问
最近使用HCT116细胞transfect shRNA (plasmid) 到10cm的dish中
使用的是K2 reagent这个牌子 所有transfect的量都是按照原文protocol建议
Day0的时候放入1000000(100万)颗细胞到dish当中
24小时後用15ug plasmid以及30ul reagent来做transfection
再过24小时之後换成complete medium
然後老师是建议我在72小时的时候收细胞这样
但是看到有几盘都是呈现要死不活的状态 收下来量都不多
这一次就是GFP还有sh-control两盘看起来最惨，很多细胞都浮起来
其他shRNA收下来的量甚至比control还多
1.这样是不是表示我这次已经失败(因为shcontrol量还更少)
不过我还是会跑wb看看蛋白质
2.实验室的助理用相同条件transfect细胞都长的ok，我想不出哪边和他不一样
他有说可能是我的DNA有问题，但是我之前也成功transfect过长的很好的GFP
3.因为用来继代的那盘细胞长的非常正常，我认为是transfect出了问题
不知道有哪边有问题请大家帮忙 ><
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1F：推 tynse71864: 1.dilute用的 serum free medium有污染吗? 08/13 12:31
2F：→ tynse71864: 2.如果transfect 24hr後才换 medium会导致死亡， 试试 08/13 12:31
3F：→ tynse71864: 看更短时间就换 (6hr之类) 08/13 12:31
4F：→ tynse71864: 另外你的细胞在 transfect後 4天才收… 他会长满吧? ( 08/13 12:33
5F：→ tynse71864: ctrl组) 08/13 12:33
6F：→ tynse71864: 其他 knock down可能本来就长不好 所以4天後还没长满 08/13 12:34
7F：→ tynse71864: 才没飘 (猜的啦) 08/13 12:34
8F：→ nellnell: serum有没有污染要等新的来了测试才知道 目前手边没有 08/13 12:37
9F：→ nellnell: 那请问如果更短的时间换complete medium，建议多久呢? 08/13 12:39
10F：→ nellnell: 怕太快就换的话DNA还没进去细胞就被我换掉了 08/13 12:39
11F：→ nellnell: HCT116根据经验 继代後放3-4天都是可以的 08/13 12:41
12F：推 tynse71864: 我是说 serum free的 medium喔～ 08/13 12:42
13F：→ tynse71864: 我没用过 k2,但一般 lipo建议6小时就换 08/13 12:42
14F：推 tynse71864: 你以前送 gfp长的很好也是用一样条件送的？ 08/13 12:44
15F：→ nellnell: 请问t大 你serum free是指哪一个步骤? 08/13 12:45
16F：→ nellnell: transfect後换的是complete medium 我应该没记错吧QQ 08/13 12:46
17F：→ nellnell: 是的 一样条件 不过是不同次抽的GFP 08/13 12:47
※ 编辑: nellnell (1.160.31.104), 08/13/2016 12:48:02
18F：推 tynse71864: dilute dna跟 K2 reagent用的 medium 08/13 13:05
19F：→ nellnell: 了解 那我先试试看6小时换complete medium 谢谢~ 08/13 13:14
20F：推 tynse71864: 不同次 GFP有机率发生问题 还是要检查看看 ? 如果 08/13 19:26
21F：→ tynse71864: tf 1天後没事，3天後有事 可能就是上面提的原因了～ 08/13 19:26