作者mountain8110 (bugyellow)
看板Biotech
標題[求救] E.coli表現R跟E表現量差異?
時間Mon Jul 25 12:50:50 2016
原PO最近在利用大腸桿菌表現重組蛋
白，遇到一點問題。
主要是利用pet22b載體在BL21菌株中，
分別表現兩段胺基酸序列，兩段序列高度
重複，除了將第一段裡面所有的E，
glutamate換成R，arginine以外。培養在
LB裡，以相同表現條件去表現OD600=0.6
時IPTG加至1mM誘導兩個小時，兩個蛋
白表現量卻差很多，有E的蛋白Band超
厚，有R的蛋白幾乎沒有表現。
原PO有去查一下，大腸桿菌合成R的
pathway主要是藉由E來產生(不確定是不
是真的，所以有E的蛋白表現量比R多還可
以接受，但R蛋白完全不表現卻不知道該
怎麼辦，有試過低溫拉長時間卻也沒什麼
用。
有去定序過了DNA序列是對的，同時E跟R
都是在所有codon裡表現機率最高的
codon，所以應該不是DNA序列的問題。
不知道各位大大有什麼建議? 像是在培養
液裡面添加什麼會比較好還是換個培養液
之類的?
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1F：→ Ianthegood: 看你的目的是什麼囉 如果只是要純化protein做in vitro 07/25 19:19
2F：→ Ianthegood: 那就養10liter啊XD inclusion body裡有嗎 07/25 19:19
3F：→ Ianthegood: 或是n端加一個tag有時候可以增加stability/solubility 07/25 19:21
4F：→ Ianthegood: R很多嗎? 07/25 19:21
5F：→ storm780121: 換其他strain? 或是codon plus的BL21? 07/25 23:31
6F：推 vivitune: 降溫，不要在37度做表現。菌株的話先試試Rosetta,pLysS, 07/26 01:39
7F：→ vivitune: 不行的話再試試takara系列的competent cell(會表達chape 07/26 01:39
8F：→ vivitune: rone) 07/26 01:39
9F：→ mountain8110: 感謝大家的建議 我先試試看一次養多一點好了 07/27 16:33
10F：→ Ice9: 以前養過含R多蛋白的菌，是真的很難養多，得不停找條件。先 07/31 18:34
11F：→ Ice9: 測低溫是不錯的選擇，然後不要養太久。 07/31 18:36
12F：→ Ice9: 後來有學長是用同時表現 Arg-tRNA 的方式解決問題。 07/31 18:43
13F：→ mountain8110: 那可以請教一下ice大 Arg-tRNA是有市售的菌株可以同 08/01 13:33
14F：→ mountain8110: 時表現 還是是學長自己插進去的外源基因? 08/01 13:33
15F：→ Ice9: V大說的 Rosetta 似乎就是特殊菌。印象中，學長是外送基因。 08/02 18:00
16F：→ Ianthegood: 還有rosetta2 我現在express的protein裡面都是R跟K 08/04 01:36