作者hotchily (ㄜ)
看板Biotech
標題[求救] western band 斷層
時間Mon Jun 27 19:29:54 2016
各位高手們好，魯妹最近在趕畢業無奈western狀況連連，請大家幫幫忙
我的目標蛋白是FAS 273kDa, internal control是tubulin 50kDa,牌子都是cell signal 的，抗體分別稀釋1000x和5000x
條件是：8%下膠 上膠4%
running:80V 跑160min
transfer buffer用10%meOH,400mA 跑150min冰浴放冰包
但結果都是這樣，以下是二重複，左右同一片膠
http://i.imgur.com/RuDbd2e.jpg
本來以為是sample再煮蛋白時溫度不夠高，但後來重新製備後FAS還是高高低低的
之前同學用一樣的條件都有壓出來，但我就是無法QQ
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1F：→ jieyuwang: 是running buffer 溢出來嗎？ 06/27 21:57
2F：→ hotchily: 沒有漏喔 06/27 22:35
3F：→ xxtomnyxx: 你在跑的時候 Dye 長怎樣？ 06/27 22:37
4F：→ hotchily: dye是正常的直直的跑下來 06/27 22:39
5F：→ xxtomnyxx: 你收一個大量的 sample，然後把這個 sample load 到除 06/27 22:49
6F：→ xxtomnyxx: 了 marker 的 9 個 lane 裡跑跑看，如果 9 個跑一樣位 06/27 22:50
7F：→ xxtomnyxx: 置，那就不是 gel 的問題，可能你的 sample 有 degrade 06/27 22:50
8F：→ xxtomnyxx: 或是這個蛋白直本身就會被裁切或修飾 06/27 22:51
9F：→ xxtomnyxx: 欸不對，連 tubulin 都有歪斜..... 06/27 22:54
10F：→ xxtomnyxx: 你請做的出來的人幫你做 gel 給你跑跑看，如果還是有問 06/27 22:55
11F：→ xxtomnyxx: 題那應該是你的 sample 處理有狀況 06/27 22:55
12F：→ hotchily: 所以不會是機器的問題嗎？電壓不穩或transfer過頭了？ 06/27 22:57
13F：推 tz2733: sample怎麼收的? 06/28 00:16
14F：推 tz2733: 另外..marker合一下可能可以給更多資訊 06/28 00:18
15F：→ hotchily: 抱歉marker沒有附在上面 06/28 01:36
16F：→ hotchily: 右邊圖上面被拉開的band是310kDa 下面的band是270左右 06/28 01:37
17F：→ hotchily: sample是PBS wash後加lysis buffer用刮板刮下來高速離 06/28 01:41
18F：→ hotchily: 心取上清液，定量完加DTT跟dye以98-100度乾浴五分鐘後存 06/28 01:41
19F：→ hotchily: 於負20 06/28 01:41
20F：推 duriamon: 可能有兩種原因，樣品鹽濃度太高或不一致和DNA太多樣品 06/28 14:34
21F：→ duriamon: 太黏。 06/28 14:34
22F：推 tynse71864: 有試過不凍直接跑嗎 07/02 09:44
23F：→ hotchily: sample是都會凍要跑時才回溫.. 07/02 16:16
24F：→ hotchily: 會試試看大家說的方法的真的很感謝各位高手們 07/02 16:16