作者hotchily (ㄜ)
看板Biotech
标题[求救] western band 断层
时间Mon Jun 27 19:29:54 2016
各位高手们好，鲁妹最近在赶毕业无奈western状况连连，请大家帮帮忙
我的目标蛋白是FAS 273kDa, internal control是tubulin 50kDa,牌子都是cell signal 的，抗体分别稀释1000x和5000x
条件是：8%下胶 上胶4%
running:80V 跑160min
transfer buffer用10%meOH,400mA 跑150min冰浴放冰包
但结果都是这样，以下是二重复，左右同一片胶
http://i.imgur.com/RuDbd2e.jpg
本来以为是sample再煮蛋白时温度不够高，但後来重新制备後FAS还是高高低低的
之前同学用一样的条件都有压出来，但我就是无法QQ
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1F：→ jieyuwang: 是running buffer 溢出来吗？ 06/27 21:57
2F：→ hotchily: 没有漏喔 06/27 22:35
3F：→ xxtomnyxx: 你在跑的时候 Dye 长怎样？ 06/27 22:37
4F：→ hotchily: dye是正常的直直的跑下来 06/27 22:39
5F：→ xxtomnyxx: 你收一个大量的 sample，然後把这个 sample load 到除 06/27 22:49
6F：→ xxtomnyxx: 了 marker 的 9 个 lane 里跑跑看，如果 9 个跑一样位 06/27 22:50
7F：→ xxtomnyxx: 置，那就不是 gel 的问题，可能你的 sample 有 degrade 06/27 22:50
8F：→ xxtomnyxx: 或是这个蛋白直本身就会被裁切或修饰 06/27 22:51
9F：→ xxtomnyxx: 欸不对，连 tubulin 都有歪斜..... 06/27 22:54
10F：→ xxtomnyxx: 你请做的出来的人帮你做 gel 给你跑跑看，如果还是有问 06/27 22:55
11F：→ xxtomnyxx: 题那应该是你的 sample 处理有状况 06/27 22:55
12F：→ hotchily: 所以不会是机器的问题吗？电压不稳或transfer过头了？ 06/27 22:57
13F：推 tz2733: sample怎麽收的? 06/28 00:16
14F：推 tz2733: 另外..marker合一下可能可以给更多资讯 06/28 00:18
15F：→ hotchily: 抱歉marker没有附在上面 06/28 01:36
16F：→ hotchily: 右边图上面被拉开的band是310kDa 下面的band是270左右 06/28 01:37
17F：→ hotchily: sample是PBS wash後加lysis buffer用刮板刮下来高速离 06/28 01:41
18F：→ hotchily: 心取上清液，定量完加DTT跟dye以98-100度乾浴五分钟後存 06/28 01:41
19F：→ hotchily: 於负20 06/28 01:41
20F：推 duriamon: 可能有两种原因，样品盐浓度太高或不一致和DNA太多样品 06/28 14:34
21F：→ duriamon: 太黏。 06/28 14:34
22F：推 tynse71864: 有试过不冻直接跑吗 07/02 09:44
23F：→ hotchily: sample是都会冻要跑时才回温.. 07/02 16:16
24F：→ hotchily: 会试试看大家说的方法的真的很感谢各位高手们 07/02 16:16