※ 引述《angel810801 (陰雨綿綿)》之銘言： : 各位版大好，小的目前在做的是要將vibrio屬的細菌做gene knockout : 由於是knockout新手 還請各位幫忙看看是不是有哪部分的思考出錯了QAQ : 使用的donor strain是E. coli S17-1 自殺載體的部分是用pk18mobsacB : 目前做到的部分是 : 透過PCR將目標基因的上下游各1000bp 接到pk18上後 轉型至S17-1內 這邊你結尾就有提到pk18可能有問題，所以之後全錯， 你的pk18可能插入到別的地方去了，或是你做出的pk18出現人為因素變異。 例如我曾經發生過enzyme切過頭，本來的plsmid大小就出錯了。 : 之後將S17-1和vibrio隔夜培養的菌液1:1混合 : 塗抹在TCBS+kan(30 ug/ml)培養基上培養O/N : 成功生長的是所謂的單交換成功吧? 不對，只表示有donor成功，不表示進入vibro內後交換到正確位置上， 你應該多選一些colony培養，然後用PCR確認插入有正確的位置。 : 因此我挑選單一黃色菌落 : 劃線分離於TCBS+10% sucrose 培養基上 : 依我之前看的paper理解 : 長出來的菌應該會是同源重組雙交換成功的菌(kan敏感以及sucrose抗性) 用PCR證實是同源重組成功，生長與否只是初步篩選。 有可能是反過來把pk18吐出去，原本基因被修補好。 : 但隨後我將colony劃線分離於LA+kan 以及 LA+10% sucrose : 結果兩者都有菌落生長 表示你的pk18進入後發生某些預料之外的事，我覺得可能是插到別的地方去了。 : 然後我將LA+10% sucrose上的菌去做目標基因的PCR : 發現基因還在 代表我knockout 失敗 : 這邊我疑惑的點是 : 如果沒有交換成功 菌體內plasmid上的sacB不是應該還存在嗎? 交換成功與否，PCR比較真實，生長與否只能確認原基因或是外源基因有無存在菌體內。 不表示在正確位置上。 : 那又為何會在sucrose plate上生長呢? : 然後我將LA+kan上的菌用LB+10% sucrose培養 過了三天了 還是很清澈 : 這樣是表明其實sacB是有作用的@@? : (當初我有將S17-1含pk18 拿去劃線在LA+10% sucrose plate : 結果長得好好的 因此我才懷疑我的sacB是不是沒有作用?) : 假設sacB有作用的話....那有什麼辦法可以增加他交換的機率嗎? : 又或者 一開始單交換那裏根本沒有成功? : 菌株會有kan抗性是因為plasmid在裡面但是並沒有嵌上chromosome? : 以上 打得有點混亂 不好意思 : ps.建構好的pk18 我一直沒辦法PCR出我插入的2000bp片段 : 可是分別1000去PCR(分別使用上游跟下游的primer) 卻都有產物 : 讓我有點困惑(使用的溫度條件都一樣 55度 10 cycle -> 58度 20 cycle) : 各位有什麼建議歡迎提供> < 分子生物操作...你永遠看不到真實發生的情況 所以生長與否只是輔助，PCR結果才比較真實，不過不表示後者一定對喔， 只是錯誤較少。 --

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