※ 引述《angel810801 (阴雨绵绵)》之铭言： : 各位版大好，小的目前在做的是要将vibrio属的细菌做gene knockout : 由於是knockout新手 还请各位帮忙看看是不是有哪部分的思考出错了QAQ : 使用的donor strain是E. coli S17-1 自杀载体的部分是用pk18mobsacB : 目前做到的部分是 : 透过PCR将目标基因的上下游各1000bp 接到pk18上後 转型至S17-1内 这边你结尾就有提到pk18可能有问题，所以之後全错， 你的pk18可能插入到别的地方去了，或是你做出的pk18出现人为因素变异。 例如我曾经发生过enzyme切过头，本来的plsmid大小就出错了。 : 之後将S17-1和vibrio隔夜培养的菌液1:1混合 : 涂抹在TCBS+kan(30 ug/ml)培养基上培养O/N : 成功生长的是所谓的单交换成功吧? 不对，只表示有donor成功，不表示进入vibro内後交换到正确位置上， 你应该多选一些colony培养，然後用PCR确认插入有正确的位置。 : 因此我挑选单一黄色菌落 : 划线分离於TCBS+10% sucrose 培养基上 : 依我之前看的paper理解 : 长出来的菌应该会是同源重组双交换成功的菌(kan敏感以及sucrose抗性) 用PCR证实是同源重组成功，生长与否只是初步筛选。 有可能是反过来把pk18吐出去，原本基因被修补好。 : 但随後我将colony划线分离於LA+kan 以及 LA+10% sucrose : 结果两者都有菌落生长 表示你的pk18进入後发生某些预料之外的事，我觉得可能是插到别的地方去了。 : 然後我将LA+10% sucrose上的菌去做目标基因的PCR : 发现基因还在 代表我knockout 失败 : 这边我疑惑的点是 : 如果没有交换成功 菌体内plasmid上的sacB不是应该还存在吗? 交换成功与否，PCR比较真实，生长与否只能确认原基因或是外源基因有无存在菌体内。 不表示在正确位置上。 : 那又为何会在sucrose plate上生长呢? : 然後我将LA+kan上的菌用LB+10% sucrose培养 过了三天了 还是很清澈 : 这样是表明其实sacB是有作用的@@? : (当初我有将S17-1含pk18 拿去划线在LA+10% sucrose plate : 结果长得好好的 因此我才怀疑我的sacB是不是没有作用?) : 假设sacB有作用的话....那有什麽办法可以增加他交换的机率吗? : 又或者 一开始单交换那里根本没有成功? : 菌株会有kan抗性是因为plasmid在里面但是并没有嵌上chromosome? : 以上 打得有点混乱 不好意思 : ps.建构好的pk18 我一直没办法PCR出我插入的2000bp片段 : 可是分别1000去PCR(分别使用上游跟下游的primer) 却都有产物 : 让我有点困惑(使用的温度条件都一样 55度 10 cycle -> 58度 20 cycle) : 各位有什麽建议欢迎提供> < 分子生物操作...你永远看不到真实发生的情况 所以生长与否只是辅助，PCR结果才比较真实，不过不表示後者一定对喔， 只是错误较少。 --

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