作者tony51501 (x-ray)
看板Biotech
標題[求救] Flow cytometry protocol(FITC)
時間Fri Mar 11 18:40:06 2016
各位大大好
小弟第一次接觸FLOW
使用的機器是BD FACSCalibur Flow Cytometry
想做經過我transfect基因後 想看細胞表面的抗原表現
有幾個想請教大家
上機之前細胞的處理
1.blocking方面大家是如何做的
我們實驗室之前學姊protocol是寫0.5 BSA/PBS 1hr
可是上網爬文,許多人好像都是用酒精?
2.一抗和二抗
我知道有直接下一次抗體(帶有FITC or PE)就可以上機的抗體
可是我做的blood group好像沒有可以直接下一次抗體
所以我是下完一抗1hr 0.5%BSA/PBS washX3 在下二抗帶有FITC(確定沒有加錯二抗)
3.FLOW機器的操作
做三次每次的X-FSC Y-SSC的圖都不是像大家的微笑曲線
然後X-FITC Y-Count 的圖 peak都沒shift(positive ctrl)
而且跑WB 是確定有transfect gene進去的
希望版上大大能幫解惑~~
感謝
補圖
http://imgur.com/TxcZ7OV.jpg
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1F：→ saviora: 有圖可看嗎03/11 19:42
我人在外面，晚點回去補圖
※ 編輯: tony51501 (27.247.22.65), 03/11/2016 20:21:41
※ 編輯: tony51501 (218.161.28.126), 03/11/2016 23:02:30
※ 編輯: tony51501 (218.161.28.126), 03/11/2016 23:09:48
2F：推 qiet: 1. blocking用酒精?你一定是誤會了什麼事情03/11 23:53
3F：→ qiet: 2. 就操作來說沒問題03/11 23:55
4F：→ qiet: 3. 你的細胞是不是死一堆不健康還是一堆碎片阿?03/11 23:55
我收細胞是用trypsin->PBS wash->0.5%BSA blocking
之後都放冰上而且離心機也都調4度C(1500rpm 5min)
我有問其他實驗室學姊他也說我的細胞狀況很差
我也不知道為什麼死那麼多QQ
5F：→ qiet: 另外能跑western blot的抗體不一定能用來看flow03/11 23:56
6F：→ qiet: 一個是看denature protein一個是有3/4級結構的阿03/11 23:57
我們老闆買的一抗
http://www.biolegend.com/anti-bg-4-antibody-11016.html
這種一抗需要避光嗎?
7F：推 lraruku: 建議你可以從原廠的操作步驟開始研究，之後修正你的操作 03/12 00:39
8F：→ lraruku: 步驟 03/12 00:39
已閱!!感謝
10F：推 ssds: 通常初學有人帶吧 問學長姐比較快03/12 00:56
11F：推 qiet: 冏, 原來是血型...03/12 01:05
有人帶~~只是在上機後的資料判讀帶的人不太會QQ
我也是去查很多資料像是'mark' 'gate' 'mean' 'geo mean'需要看哪個以及代表的意義
12F：推 jabari: no-gate.... 先把ssc/fsc 左下角的渣渣們去掉03/12 02:12
13F：推 tz2733: WB跟flow是看同一個蛋白質嗎?確認有送進去跟你細胞有改變(03/12 11:10
14F：→ tz2733: flow要看的表面抗原有表現)可能會是兩件事喔~03/12 11:10
不知道什麼樣的gate才是最好的,是gate微笑曲線嗎?
WB我是壓帶有tag的plasmid,flow則是抓細胞表面的antigen,希望我的一抗是有work的
※ 編輯: tony51501 (218.161.28.126), 03/12/2016 11:54:23
15F：推 conective: 一抗是ihc的 不代表可以做FLOW唷 03/12 12:20
16F：→ conective: 看起來是沒有螢光表現03/12 12:21
好的,我也正想跟我們老闆討論看看!!
※ 編輯: tony51501 (218.161.28.126), 03/12/2016 13:34:58
17F：推 tz2733: gate是要找你主要細胞群圈選出來 你fsc跟ssc上機時要不要03/12 14:33
18F：→ tz2733: 調小一點 因為點圖右邊那群被切一半的細胞會不會才是你要03/12 14:33
19F：→ tz2733: 看的細胞??03/12 14:33
已經調最小了欸QQ，還是要把電壓調E-00我忘記是什麼可是好像可以縮小觀察細胞
20F：推 qiet: 應該還是找的到flow能用的抗體, 另外也許要是有個對照組03/12 23:05
21F：→ qiet: 應該可以幫助找到條件...抽點血之類的XDD03/12 23:07
22F：→ qiet: eBioscience有同樣的clone有加螢光但一樣沒說是否Flow可做03/12 23:08
好的，我再找找試試看
23F：推 Cheinder: 感覺有大部分沒染到 可以了解一下在螢光0以下的細胞比例03/13 15:54
24F：→ Cheinder: 來檢視染色效果 若不佳 可換二抗看看 在換一抗試試03/13 15:55
嗯嗯，那要花一些時間test了！
※ 編輯: tony51501 (27.247.6.19), 03/13/2016 23:11:44
25F：推 jabari: 你先試run個PI stain. 抓到感覺再跑你的sample 03/14 00:22
26F：→ jabari: btw 要看表現 直接細胞染色看IFA會不會簡單點 03/14 00:24
好的，我查查看或問人怎麼做好了！謝謝你
對了，染P I不是看cell cycle的狀況嗎？然後我現在做應該就是indirect吧？
27F：推 tz2733: 如果你現在是用E01 數值也無法再調小 那要變小的確是改03/14 09:04
28F：→ tz2733: 成E00沒錯 然後再調整數值至欲觀察細胞群"位在畫面中間且03/14 09:04
29F：→ tz2733: 成群" 加油~03/14 09:04
我好像是用E00，有試過改成E-1，調整以後可以像微笑曲線，這樣不知道可不可以，謝謝
你！
※ 編輯: tony51501 (39.9.15.100), 03/14/2016 14:50:43
※ 編輯: tony51501 (39.9.15.100), 03/14/2016 15:23:10
30F：推 conective: 重點是有看到細胞 電壓值跟你細胞大小有關 沒有標準答03/14 21:52
31F：→ conective: 案03/14 21:52
32F：→ conective: 你有沒有Positive control 就是必定會染上的組別?03/14 21:54
有做但是效果好像沒有很好，我再想是不是我細胞的問題，可是繼代存活率有96%說Q Q
※ 編輯: tony51501 (27.246.200.215), 03/15/2016 15:29:16
33F：→ a90648: 連positive control都很弱怎麼會懷疑是細胞問題?03/15 19:03
因為我沒有圈gata，細胞累積圖整個很分散，死細胞無法bind到抗體，因此分母變大很多
，分子不變，所以pick看起來就好像沒有shift
※ 編輯: tony51501 (27.247.39.155), 03/15/2016 23:46:11
34F：→ a90648: 有訊號即使%還是會看到shift03/16 11:25
35F：→ a90648: %"少" 漏字，你的圖看起來比較像是沒訊號不是%少 03/16 11:28
我positive的圖沒有放上來，是有shift一點但不明顯
※ 編輯: tony51501 (39.12.90.126), 03/17/2016 09:52:56