作者tony51501 (x-ray)
看板Biotech
标题[求救] Flow cytometry protocol(FITC)
时间Fri Mar 11 18:40:06 2016
各位大大好
小弟第一次接触FLOW
使用的机器是BD FACSCalibur Flow Cytometry
想做经过我transfect基因後 想看细胞表面的抗原表现
有几个想请教大家
上机之前细胞的处理
1.blocking方面大家是如何做的
我们实验室之前学姊protocol是写0.5 BSA/PBS 1hr
可是上网爬文,许多人好像都是用酒精?
2.一抗和二抗
我知道有直接下一次抗体(带有FITC or PE)就可以上机的抗体
可是我做的blood group好像没有可以直接下一次抗体
所以我是下完一抗1hr 0.5%BSA/PBS washX3 在下二抗带有FITC(确定没有加错二抗)
3.FLOW机器的操作
做三次每次的X-FSC Y-SSC的图都不是像大家的微笑曲线
然後X-FITC Y-Count 的图 peak都没shift(positive ctrl)
而且跑WB 是确定有transfect gene进去的
希望版上大大能帮解惑~~
感谢
补图
http://imgur.com/TxcZ7OV.jpg
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1F：→ saviora: 有图可看吗03/11 19:42
我人在外面，晚点回去补图
※ 编辑: tony51501 (27.247.22.65), 03/11/2016 20:21:41
※ 编辑: tony51501 (218.161.28.126), 03/11/2016 23:02:30
※ 编辑: tony51501 (218.161.28.126), 03/11/2016 23:09:48
2F：推 qiet: 1. blocking用酒精?你一定是误会了什麽事情03/11 23:53
3F：→ qiet: 2. 就操作来说没问题03/11 23:55
4F：→ qiet: 3. 你的细胞是不是死一堆不健康还是一堆碎片阿?03/11 23:55
我收细胞是用trypsin->PBS wash->0.5%BSA blocking
之後都放冰上而且离心机也都调4度C(1500rpm 5min)
我有问其他实验室学姊他也说我的细胞状况很差
我也不知道为什麽死那麽多QQ
5F：→ qiet: 另外能跑western blot的抗体不一定能用来看flow03/11 23:56
6F：→ qiet: 一个是看denature protein一个是有3/4级结构的阿03/11 23:57
我们老板买的一抗
http://www.biolegend.com/anti-bg-4-antibody-11016.html
这种一抗需要避光吗?
7F：推 lraruku: 建议你可以从原厂的操作步骤开始研究，之後修正你的操作 03/12 00:39
8F：→ lraruku: 步骤 03/12 00:39
已阅!!感谢
10F：推 ssds: 通常初学有人带吧 问学长姐比较快03/12 00:56
11F：推 qiet: 冏, 原来是血型...03/12 01:05
有人带~~只是在上机後的资料判读带的人不太会QQ
我也是去查很多资料像是'mark' 'gate' 'mean' 'geo mean'需要看哪个以及代表的意义
12F：推 jabari: no-gate.... 先把ssc/fsc 左下角的渣渣们去掉03/12 02:12
13F：推 tz2733: WB跟flow是看同一个蛋白质吗?确认有送进去跟你细胞有改变(03/12 11:10
14F：→ tz2733: flow要看的表面抗原有表现)可能会是两件事喔~03/12 11:10
不知道什麽样的gate才是最好的,是gate微笑曲线吗?
WB我是压带有tag的plasmid,flow则是抓细胞表面的antigen,希望我的一抗是有work的
※ 编辑: tony51501 (218.161.28.126), 03/12/2016 11:54:23
15F：推 conective: 一抗是ihc的 不代表可以做FLOW唷 03/12 12:20
16F：→ conective: 看起来是没有萤光表现03/12 12:21
好的,我也正想跟我们老板讨论看看!!
※ 编辑: tony51501 (218.161.28.126), 03/12/2016 13:34:58
17F：推 tz2733: gate是要找你主要细胞群圈选出来 你fsc跟ssc上机时要不要03/12 14:33
18F：→ tz2733: 调小一点 因为点图右边那群被切一半的细胞会不会才是你要03/12 14:33
19F：→ tz2733: 看的细胞??03/12 14:33
已经调最小了欸QQ，还是要把电压调E-00我忘记是什麽可是好像可以缩小观察细胞
20F：推 qiet: 应该还是找的到flow能用的抗体, 另外也许要是有个对照组03/12 23:05
21F：→ qiet: 应该可以帮助找到条件...抽点血之类的XDD03/12 23:07
22F：→ qiet: eBioscience有同样的clone有加萤光但一样没说是否Flow可做03/12 23:08
好的，我再找找试试看
23F：推 Cheinder: 感觉有大部分没染到 可以了解一下在萤光0以下的细胞比例03/13 15:54
24F：→ Cheinder: 来检视染色效果 若不佳 可换二抗看看 在换一抗试试03/13 15:55
嗯嗯，那要花一些时间test了！
※ 编辑: tony51501 (27.247.6.19), 03/13/2016 23:11:44
25F：推 jabari: 你先试run个PI stain. 抓到感觉再跑你的sample 03/14 00:22
26F：→ jabari: btw 要看表现 直接细胞染色看IFA会不会简单点 03/14 00:24
好的，我查查看或问人怎麽做好了！谢谢你
对了，染P I不是看cell cycle的状况吗？然後我现在做应该就是indirect吧？
27F：推 tz2733: 如果你现在是用E01 数值也无法再调小 那要变小的确是改03/14 09:04
28F：→ tz2733: 成E00没错 然後再调整数值至欲观察细胞群"位在画面中间且03/14 09:04
29F：→ tz2733: 成群" 加油~03/14 09:04
我好像是用E00，有试过改成E-1，调整以後可以像微笑曲线，这样不知道可不可以，谢谢
你！
※ 编辑: tony51501 (39.9.15.100), 03/14/2016 14:50:43
※ 编辑: tony51501 (39.9.15.100), 03/14/2016 15:23:10
30F：推 conective: 重点是有看到细胞 电压值跟你细胞大小有关 没有标准答03/14 21:52
31F：→ conective: 案03/14 21:52
32F：→ conective: 你有没有Positive control 就是必定会染上的组别?03/14 21:54
有做但是效果好像没有很好，我再想是不是我细胞的问题，可是继代存活率有96%说Q Q
※ 编辑: tony51501 (27.246.200.215), 03/15/2016 15:29:16
33F：→ a90648: 连positive control都很弱怎麽会怀疑是细胞问题?03/15 19:03
因为我没有圈gata，细胞累积图整个很分散，死细胞无法bind到抗体，因此分母变大很多
，分子不变，所以pick看起来就好像没有shift
※ 编辑: tony51501 (27.247.39.155), 03/15/2016 23:46:11
34F：→ a90648: 有讯号即使%还是会看到shift03/16 11:25
35F：→ a90648: %"少" 漏字，你的图看起来比较像是没讯号不是%少 03/16 11:28
我positive的图没有放上来，是有shift一点但不明显
※ 编辑: tony51501 (39.12.90.126), 03/17/2016 09:52:56