各位版大好 小弟最近在做L.lactis的電穿孔實驗 不過不知道為何質體一直打不進細胞中 在培養基上只會有一層淡白色菌液 沒有菌落出現 如果刮取一點菌液塗到沒有抗生素的培養基上 約16~18hr 就會有滿滿的菌落出現 跟老師討論的結果 他說細胞還活著 但質體沒有打進去 他也不知道怎麼回事 因為他在美國做過相同的實驗 都很順利的在兩天內長出菌落出來 所以想問問各位版大的意見 實驗方法是以L.lactis MG1363 製作勝任細胞 第一天養在含有glucose(碳源) glycine(抑制細胞壁) sucrose(穩定滲透壓)的M17培養基 第二天以相同的培養基做100倍放大培養至OD0.3~0.5(約10E+08 CFU/ml) 之後以glycerol+sucrose的washing buffer在4度C清洗3次 最後以1 ml的washing buffer resuspend 分裝存於-80度 在執行電穿孔時是用2mm cuvette(預冷) ,50ul cell , ~300ng/ul DNA 以2.25KV 50uF 嘗試過129與246的電阻 沒有電弧產生 回復液是M17+glucose+sucrose+CaCl2+MgCl2(預冷) 在32度C回復2小時 取約100ul塗在含有Chloramphenicol(5ug/ml)的SGM17 plate上 DNA的來源是老師從美國帶回來後先以heat shock法打入E.coli DH5α中保存再抽出 在美國則是以E.coli JM109保存 質體大小約10kb 帶有CM resistant 謝謝各位 --

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