各位版大好 小弟最近在做L.lactis的电穿孔实验 不过不知道为何质体一直打不进细胞中 在培养基上只会有一层淡白色菌液 没有菌落出现 如果刮取一点菌液涂到没有抗生素的培养基上 约16~18hr 就会有满满的菌落出现 跟老师讨论的结果 他说细胞还活着 但质体没有打进去 他也不知道怎麽回事 因为他在美国做过相同的实验 都很顺利的在两天内长出菌落出来 所以想问问各位版大的意见 实验方法是以L.lactis MG1363 制作胜任细胞 第一天养在含有glucose(碳源) glycine(抑制细胞壁) sucrose(稳定渗透压)的M17培养基 第二天以相同的培养基做100倍放大培养至OD0.3~0.5(约10E+08 CFU/ml) 之後以glycerol+sucrose的washing buffer在4度C清洗3次 最後以1 ml的washing buffer resuspend 分装存於-80度 在执行电穿孔时是用2mm cuvette(预冷) ,50ul cell , ~300ng/ul DNA 以2.25KV 50uF 尝试过129与246的电阻 没有电弧产生 回复液是M17+glucose+sucrose+CaCl2+MgCl2(预冷) 在32度C回复2小时 取约100ul涂在含有Chloramphenicol(5ug/ml)的SGM17 plate上 DNA的来源是老师从美国带回来後先以heat shock法打入E.coli DH5α中保存再抽出 在美国则是以E.coli JM109保存 质体大小约10kb 带有CM resistant 谢谢各位 --

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