作者tynse71864 (TATA box)
看板Biotech
標題[求救] Culture medium western
時間Sat Jan 9 13:07:01 2016
大家好
我的實驗想看在culture medium (10%FBS) 裡
overexpress的 target protein 有多少被secret出來
因此目前的做法是
直接收mediumm，loading 約1/500下去做western
western壓的到我要看的protein(16~17kda) 但是極醜....
http://0rz.tw/UMKNU
由於medium中有很多BSA / IgG / lipid雜七雜八的東西
所以跑的時候會大扭曲
目前沒有考慮做elisa (因為secretion的量很多
抗體也無法做IP
因此想知道有無方法 可以處理這樣子的sample
讓western不會跑歪
目前有想到的方法是:
1.Dilute sample，取更少的量
(但因為之後要做endogenous，我怕之後此方法會不能用
2.加一些detergent進去 (?) 如SDS
查過的paper都只有寫 load medium，不太會寫怎麼處理
想問有無類似經驗的版友們可以分享經驗呢?
謝謝!
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1F：→ tynse71864: 順問一下，縮網址這樣子OK嗎 (?)01/09 13:08
2F：推 rasaze: 為什麼量大就不做ELISA?01/09 14:10
3F：→ tynse71864: 抗體是自己打的 也不確定能不能做 ELISA01/09 15:16
4F：→ tynse71864: WB相對簡單01/09 15:16
5F：→ xxtomnyxx: Cell line 是什麼？如果是 HEK293 可以試試用 CD29301/09 18:06
6F：→ xxtomnyxx: medium，只是有點貴.....01/09 18:06
Hela 一般 DMEM
7F：→ xxtomnyxx: Hela 也有 serum free 的 medium，你實驗室肯花錢就去 01/09 21:12
8F：→ xxtomnyxx: 買來用用看，有另一個方法是可以用 centricon 把高分子 01/09 21:13
9F：→ xxtomnyxx: 量的物質濾掉。 01/09 21:14
10F：→ milkpa: 16-17KDa直接用30KDa篩掉濃縮就可以了 01/09 21:19
serum free對我來說不太可行 我的蛋白對serum敏感
有centricon這種東西阿...我來找找看
剛剛找researchgate時也有看到
11F：推 lail: IP你的target protein? 01/10 00:39
我的抗體不能IP喔 (已試過
12F：→ roy047: 上半部可以裁掉再下一抗... 01/10 00:54
這樣還是沒解決land會跑歪的問題吧@@
13F：→ Ice9: 有 load FBS-only 的 lane 嗎？ 01/10 01:48
你是說 100%FBS 直接Loading嗎
我是有直接下過沒養過細胞的medium 就...上方歪的更可怕
14F：推 randolph80: 有跑普通的western確定過不是膠的問題嗎 01/10 18:58
確定 我跑lysate一切正常, 只有medium會出事
也有其他實驗用過3%BSA medium, 跑出來更可怕
※ 編輯: tynse71864 (140.109.32.9), 01/10/2016 19:45:35
15F：→ Ice9: 等比例loading。但下東西以前可以稍微計算一下gel的允許量。 01/10 19:54
16F：推 ko363630: 用centricon離心濃縮比較理想 01/11 00:07
17F：推 randolph80: 膠的%數降低，電壓降低試試看 01/11 10:40