作者tynse71864 (TATA box)
看板Biotech
标题[求救] Culture medium western
时间Sat Jan 9 13:07:01 2016
大家好
我的实验想看在culture medium (10%FBS) 里
overexpress的 target protein 有多少被secret出来
因此目前的做法是
直接收mediumm，loading 约1/500下去做western
western压的到我要看的protein(16~17kda) 但是极丑....
http://0rz.tw/UMKNU
由於medium中有很多BSA / IgG / lipid杂七杂八的东西
所以跑的时候会大扭曲
目前没有考虑做elisa (因为secretion的量很多
抗体也无法做IP
因此想知道有无方法 可以处理这样子的sample
让western不会跑歪
目前有想到的方法是:
1.Dilute sample，取更少的量
(但因为之後要做endogenous，我怕之後此方法会不能用
2.加一些detergent进去 (?) 如SDS
查过的paper都只有写 load medium，不太会写怎麽处理
想问有无类似经验的版友们可以分享经验呢?
谢谢!
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1F：→ tynse71864: 顺问一下，缩网址这样子OK吗 (?)01/09 13:08
2F：推 rasaze: 为什麽量大就不做ELISA?01/09 14:10
3F：→ tynse71864: 抗体是自己打的 也不确定能不能做 ELISA01/09 15:16
4F：→ tynse71864: WB相对简单01/09 15:16
5F：→ xxtomnyxx: Cell line 是什麽？如果是 HEK293 可以试试用 CD29301/09 18:06
6F：→ xxtomnyxx: medium，只是有点贵.....01/09 18:06
Hela 一般 DMEM
7F：→ xxtomnyxx: Hela 也有 serum free 的 medium，你实验室肯花钱就去 01/09 21:12
8F：→ xxtomnyxx: 买来用用看，有另一个方法是可以用 centricon 把高分子 01/09 21:13
9F：→ xxtomnyxx: 量的物质滤掉。 01/09 21:14
10F：→ milkpa: 16-17KDa直接用30KDa筛掉浓缩就可以了 01/09 21:19
serum free对我来说不太可行 我的蛋白对serum敏感
有centricon这种东西阿...我来找找看
刚刚找researchgate时也有看到
11F：推 lail: IP你的target protein? 01/10 00:39
我的抗体不能IP喔 (已试过
12F：→ roy047: 上半部可以裁掉再下一抗... 01/10 00:54
这样还是没解决land会跑歪的问题吧@@
13F：→ Ice9: 有 load FBS-only 的 lane 吗？ 01/10 01:48
你是说 100%FBS 直接Loading吗
我是有直接下过没养过细胞的medium 就...上方歪的更可怕
14F：推 randolph80: 有跑普通的western确定过不是胶的问题吗 01/10 18:58
确定 我跑lysate一切正常, 只有medium会出事
也有其他实验用过3%BSA medium, 跑出来更可怕
※ 编辑: tynse71864 (140.109.32.9), 01/10/2016 19:45:35
15F：→ Ice9: 等比例loading。但下东西以前可以稍微计算一下gel的允许量。 01/10 19:54
16F：推 ko363630: 用centricon离心浓缩比较理想 01/11 00:07
17F：推 randolph80: 胶的%数降低，电压降低试试看 01/11 10:40