作者Marrisay (可愛的Comomo)
看板Biotech
標題[求救] blunt-end DNA ligation
時間Thu Dec 24 06:26:08 2015
我是第一次使用DNA ligase IV做blunt-end DNA ligation實驗
最近做了很多次，但一直做不出來><
希望大家能幫我偵錯及給予一些建議！
我的實驗步驟如下：
1. 準備ligation buffer (50 mM Tris-HCl pH8.0, 10 mM DTT, 75 mM KCl, 10 mM MgCl
2, 1 mM ATP, 10% PEG10000)
2. 將Ku70/80及ligase IV/XRCC4加入ligation buffer後，置室溫15 min
3. 將p32-blunt-end DNA加入混合液中，置37度C反應1 hr
4. 加入stop loading buffer及95度C加熱5 min
5. Run 15% TBE-Urea gel, 然後壓片及顯影
謝謝大家！
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1F：→ blence: recombinant是自製的? 12/24 10:18
2F：→ Marrisay: 對，ligase IV/XRCC4 complex是自製的 12/24 12:34
3F：→ Marrisay: Ku70/80也是 12/24 12:35
4F：→ blence: 過這lig4如果是Ecoli會不會沒有活性,還是你用Sf9或invitro 12/24 13:53
5F：→ blence: 如Hela lysate之類做的? 12/24 13:54
6F：→ blence: 對了,你是只要接起來?要測in vitro NHEJ效率?還是只想看 12/24 14:58
7F：→ blence: lig4 activity? 如果是只看lig4/xrcc4,應該不必用ku70/80 12/24 15:00
8F：→ blence: 設計nick就可以了? 12/24 15:03
9F：→ Ice9: 你的DNA中P32 incorporate效率多高？有『多熱』？純化過？ 12/24 17:19
10F：→ Ice9: 壓片壓多久？壓片條件呢？ 12/24 17:20
11F：→ Ice9: 有失敗的片子可以看嗎？ 12/24 17:21
12F：→ Marrisay: 謝謝大家的回應，我一起回答大家的問題。我是用SF9表達 12/25 06:24
13F：→ Marrisay: 的protein(E.coli的ligase4 complex沒活性嗎？)，我只是 12/25 06:25
14F：→ Marrisay: 想用lig4/XRCC4將blunt-end DNA接起來，另外，我不知inc 12/25 06:25
15F：→ Marrisay: orporate的效率是多少^^''(如何檢測呢？)，但我有過G-25 12/25 06:25
16F：→ Marrisay: column去除free p32-ATP。我將gel浸泡在fixed buffer 12/25 06:25
17F：→ Marrisay: 內30 min後，乾膠及壓片24hr後顯影。最後失敗的片子上只 12/25 06:25
18F：→ Marrisay: 有未修復的單股DNA訊號，而沒有連接起來的DNA訊號 12/25 06:25
19F：→ blence: lig4/xrcc4不小,用Ecoli可能folding會不OK;如果是接blunt 12/25 08:43
20F：→ blence: 那用T4 lig可以排除P32 label問題,但是lig4的功能不是做為 12/25 08:48
21F：→ blence: blunt end ligation,而是NHEJ/Ku-dependent nick ligation 12/25 08:51
22F：→ Marrisay: 我的印象中，lig4在NHEJ pathway中扮演連接DSB的角色， 12/25 13:07
23F：→ Marrisay: 只是不知道為什麼in vitro的實驗一直做不出來，是不是步 12/25 13:07
24F：→ Marrisay: 驟出了問題？或有地方沒有做好？ 12/25 13:07
25F：→ Ice9: 你的ATP 是買gamma還是alpha？ 另外，再壓久一點呢？ 12/25 18:02
26F：→ Ice9: 怎麼會想要用SF9來表達細菌的蛋白呢？修飾系統完全不一樣。y 12/25 18:08
27F：→ Ice9: 你有positive control嗎？例如T4 DNA ligase同時做來比較。 12/25 18:08
28F：→ Ice9: 關於incorporate ratio的計算，我忘了，要再回去翻資料，和 12/25 18:49
29F：→ Ice9: 通column前後的isotope值有關，希望你有留下計數資料。另外 12/25 18:50
30F：→ Ice9: 拿去做ligation的specific activity是多少？或者說你拿多少 12/25 18:51
31F：→ Ice9: cpm/amount 進行ligation？ 12/25 18:58
32F：→ blence: 樓上完全搞錯了,Ku70/80及lig/xrcc4都是mammalian才有 12/26 12:22
33F：→ blence: 原po是用Sf9表現人類蛋白;細菌NHEJ不是這些名字 12/26 12:30
34F：→ blence: 我以為lig4/xrcc4跟lig1或lig3等最大差別不是接blunt end 12/26 12:36
35F：→ blence: 而是Ku或其他factor recruited,所以會先懷疑這樣的 12/26 12:38
36F：→ blence: reconstructional是有人確認過,或有沒有需要其他factors 12/26 12:41
37F：→ blence: 所以blunt end ligation分開成join 2end與nick ligate兩個 12/26 12:43
38F：→ Ice9: 感謝b大指正。難怪這些名稱有些眼熟…… 12/26 13:46