作者Marrisay (可爱的Comomo)
看板Biotech
标题[求救] blunt-end DNA ligation
时间Thu Dec 24 06:26:08 2015
我是第一次使用DNA ligase IV做blunt-end DNA ligation实验
最近做了很多次，但一直做不出来><
希望大家能帮我侦错及给予一些建议！
我的实验步骤如下：
1. 准备ligation buffer (50 mM Tris-HCl pH8.0, 10 mM DTT, 75 mM KCl, 10 mM MgCl
2, 1 mM ATP, 10% PEG10000)
2. 将Ku70/80及ligase IV/XRCC4加入ligation buffer後，置室温15 min
3. 将p32-blunt-end DNA加入混合液中，置37度C反应1 hr
4. 加入stop loading buffer及95度C加热5 min
5. Run 15% TBE-Urea gel, 然後压片及显影
谢谢大家！
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1F：→ blence: recombinant是自制的? 12/24 10:18
2F：→ Marrisay: 对，ligase IV/XRCC4 complex是自制的 12/24 12:34
3F：→ Marrisay: Ku70/80也是 12/24 12:35
4F：→ blence: 过这lig4如果是Ecoli会不会没有活性,还是你用Sf9或invitro 12/24 13:53
5F：→ blence: 如Hela lysate之类做的? 12/24 13:54
6F：→ blence: 对了,你是只要接起来?要测in vitro NHEJ效率?还是只想看 12/24 14:58
7F：→ blence: lig4 activity? 如果是只看lig4/xrcc4,应该不必用ku70/80 12/24 15:00
8F：→ blence: 设计nick就可以了? 12/24 15:03
9F：→ Ice9: 你的DNA中P32 incorporate效率多高？有『多热』？纯化过？ 12/24 17:19
10F：→ Ice9: 压片压多久？压片条件呢？ 12/24 17:20
11F：→ Ice9: 有失败的片子可以看吗？ 12/24 17:21
12F：→ Marrisay: 谢谢大家的回应，我一起回答大家的问题。我是用SF9表达 12/25 06:24
13F：→ Marrisay: 的protein(E.coli的ligase4 complex没活性吗？)，我只是 12/25 06:25
14F：→ Marrisay: 想用lig4/XRCC4将blunt-end DNA接起来，另外，我不知inc 12/25 06:25
15F：→ Marrisay: orporate的效率是多少^^''(如何检测呢？)，但我有过G-25 12/25 06:25
16F：→ Marrisay: column去除free p32-ATP。我将gel浸泡在fixed buffer 12/25 06:25
17F：→ Marrisay: 内30 min後，乾胶及压片24hr後显影。最後失败的片子上只 12/25 06:25
18F：→ Marrisay: 有未修复的单股DNA讯号，而没有连接起来的DNA讯号 12/25 06:25
19F：→ blence: lig4/xrcc4不小,用Ecoli可能folding会不OK;如果是接blunt 12/25 08:43
20F：→ blence: 那用T4 lig可以排除P32 label问题,但是lig4的功能不是做为 12/25 08:48
21F：→ blence: blunt end ligation,而是NHEJ/Ku-dependent nick ligation 12/25 08:51
22F：→ Marrisay: 我的印象中，lig4在NHEJ pathway中扮演连接DSB的角色， 12/25 13:07
23F：→ Marrisay: 只是不知道为什麽in vitro的实验一直做不出来，是不是步 12/25 13:07
24F：→ Marrisay: 骤出了问题？或有地方没有做好？ 12/25 13:07
25F：→ Ice9: 你的ATP 是买gamma还是alpha？ 另外，再压久一点呢？ 12/25 18:02
26F：→ Ice9: 怎麽会想要用SF9来表达细菌的蛋白呢？修饰系统完全不一样。y 12/25 18:08
27F：→ Ice9: 你有positive control吗？例如T4 DNA ligase同时做来比较。 12/25 18:08
28F：→ Ice9: 关於incorporate ratio的计算，我忘了，要再回去翻资料，和 12/25 18:49
29F：→ Ice9: 通column前後的isotope值有关，希望你有留下计数资料。另外 12/25 18:50
30F：→ Ice9: 拿去做ligation的specific activity是多少？或者说你拿多少 12/25 18:51
31F：→ Ice9: cpm/amount 进行ligation？ 12/25 18:58
32F：→ blence: 楼上完全搞错了,Ku70/80及lig/xrcc4都是mammalian才有 12/26 12:22
33F：→ blence: 原po是用Sf9表现人类蛋白;细菌NHEJ不是这些名字 12/26 12:30
34F：→ blence: 我以为lig4/xrcc4跟lig1或lig3等最大差别不是接blunt end 12/26 12:36
35F：→ blence: 而是Ku或其他factor recruited,所以会先怀疑这样的 12/26 12:38
36F：→ blence: reconstructional是有人确认过,或有没有需要其他factors 12/26 12:41
37F：→ blence: 所以blunt end ligation分开成join 2end与nick ligate两个 12/26 12:43
38F：→ Ice9: 感谢b大指正。难怪这些名称有些眼熟…… 12/26 13:46