作者kgwu (徵5/2 獅象戰內野優待票)
看板Biotech
標題[求救] 細胞表面接受器偵測
時間Wed Sep 9 16:17:11 2015
最近在做肝癌細胞表面蛋白偵測
使用流式細胞儀來進行偵測
希望細胞在加藥處理後，細胞表面的接受器會增加
目前到的問題是:
實驗已經進行3次以上，但是結果並不穩定
有時會增加，有時沒有變化
有時control的值在不同次的實驗中，飄移(增加)有點多
因為已經有另一實驗結果可佐證表面接受器有增加的情況
所以我認為FLOW做出來的DATA應該也會增加才是
我的實驗步驟為:
1. 細胞seeding 24小時後，加藥處理
2. 加藥24小時後，收集細胞，上機
收集細胞步驟:
1.PBS wash細胞，利用trypsin將細胞切下，收集於離心管中
2.離心後，移除上清液，利用含有1% FBS的PBS沖洗細胞，離心 (此步驟進行兩次)
3.移除上清液，用含有1% FBS的PBS沖散細胞，靜置於冰上20分鐘
4.離心，用PBS將細胞打散，加入抗體，避光並靜置於冰上45分鐘
5.離心，移除上清液，用PBS沖洗細胞 (此步驟進行兩次)
6.離心，移除上清液，加入適量的PBS沖散細胞，上機
不知步驟是否有可改進之處? 或是有其他可改善的方法?
請各位版友不吝指教~感謝!
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1F：→ Ice9: 會不會是 trypsinize 的步驟造成。要不要把這一步的條件詳述 09/09 18:05
2F：→ Ice9: 一下？另外，可以參考版友aaaazzzz的那一篇及討論串內容。 09/09 18:06
3F：→ kgwu: 細胞是seeding在6 cm dish, trypsin 是剛從冰箱拿出來 09/09 19:37
4F：→ kgwu: 的，加入200ul的冰冷trypsin,將細胞放入37度培養箱三 09/09 19:37
5F：→ kgwu: 分鐘，用medium將細胞沖下，收集於離心管中 09/09 19:37
6F：→ milkpa: 都要看表面蛋白質了，就別用trypsin，改用2％EDTA之類 09/09 21:54
7F：→ kgwu: 感謝建議 09/09 22:17
8F：→ aaaazzzz: 我先前看膜蛋白也用trypsin，請教這樣會有什麼樣的影響? 09/10 22:56
9F：→ aaaazzzz: 附帶一問，我用trypsin打下癌細胞後，去跑flow，會發現 09/10 22:58
10F：推 aaaazzzz: 細胞變得非常黏稠，黏稠程度甚至形成團塊,吸起來還會黏 09/10 23:01
11F：→ aaaazzzz: 在塑膠tip上，不曉得和trypsin使用過長的時間有關？ 09/10 23:01
12F：推 ChesterYeah: 打太久、細胞太濃、trysin太濃 09/13 21:00