作者kgwu (徵5/2 狮象战内野优待票)
看板Biotech
标题[求救] 细胞表面接受器侦测
时间Wed Sep 9 16:17:11 2015
最近在做肝癌细胞表面蛋白侦测
使用流式细胞仪来进行侦测
希望细胞在加药处理後，细胞表面的接受器会增加
目前到的问题是:
实验已经进行3次以上，但是结果并不稳定
有时会增加，有时没有变化
有时control的值在不同次的实验中，飘移(增加)有点多
因为已经有另一实验结果可佐证表面接受器有增加的情况
所以我认为FLOW做出来的DATA应该也会增加才是
我的实验步骤为:
1. 细胞seeding 24小时後，加药处理
2. 加药24小时後，收集细胞，上机
收集细胞步骤:
1.PBS wash细胞，利用trypsin将细胞切下，收集於离心管中
2.离心後，移除上清液，利用含有1% FBS的PBS冲洗细胞，离心 (此步骤进行两次)
3.移除上清液，用含有1% FBS的PBS冲散细胞，静置於冰上20分钟
4.离心，用PBS将细胞打散，加入抗体，避光并静置於冰上45分钟
5.离心，移除上清液，用PBS冲洗细胞 (此步骤进行两次)
6.离心，移除上清液，加入适量的PBS冲散细胞，上机
不知步骤是否有可改进之处? 或是有其他可改善的方法?
请各位版友不吝指教~感谢!
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 210.60.190.100
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1441786633.A.E74.html
1F：→ Ice9: 会不会是 trypsinize 的步骤造成。要不要把这一步的条件详述 09/09 18:05
2F：→ Ice9: 一下？另外，可以参考版友aaaazzzz的那一篇及讨论串内容。 09/09 18:06
3F：→ kgwu: 细胞是seeding在6 cm dish, trypsin 是刚从冰箱拿出来 09/09 19:37
4F：→ kgwu: 的，加入200ul的冰冷trypsin,将细胞放入37度培养箱三 09/09 19:37
5F：→ kgwu: 分钟，用medium将细胞冲下，收集於离心管中 09/09 19:37
6F：→ milkpa: 都要看表面蛋白质了，就别用trypsin，改用2％EDTA之类 09/09 21:54
7F：→ kgwu: 感谢建议 09/09 22:17
8F：→ aaaazzzz: 我先前看膜蛋白也用trypsin，请教这样会有什麽样的影响? 09/10 22:56
9F：→ aaaazzzz: 附带一问，我用trypsin打下癌细胞後，去跑flow，会发现 09/10 22:58
10F：推 aaaazzzz: 细胞变得非常黏稠，黏稠程度甚至形成团块,吸起来还会黏 09/10 23:01
11F：→ aaaazzzz: 在塑胶tip上，不晓得和trypsin使用过长的时间有关？ 09/10 23:01
12F：推 ChesterYeah: 打太久、细胞太浓、trysin太浓 09/13 21:00