作者a7225463 (明智)
看板Biotech
標題[求救] TA cloning相關問題
時間Mon Jul 27 19:08:54 2015
我是借用朋友帳號po文的...謝謝
小妹我先用Taq p出我要的片段約650 np，然後照invitrogen的TOPO TA Cloning附的prot
ocol進行ligation:取1 ul的PCR產物及2 ul的pCR2.1 vector作用室溫1 hr，接著做trans
formation用藍白篩，結果有長白的colony也有藍的，我挑白的做mini-prep再用EcoRI 切
我抽的DNA後，完全切不到我要的片段...就像insert根本沒接進去ㄧ樣...但沒接進去的話c
olony的顏色怎麼會是白的勒？
所以我想請問各位大大 是否可以告知我是哪邊實驗出問題了勒？謝謝大家～
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1F：推 jabari: 哪隻Taq? 有純化? 用了topo接不出來 經費表示傷心 07/27 21:16
2F：推 huuban: plat是新鮮的嗎？ 07/27 22:09
3F：→ blence: 沒照protocol時間;沒純化產物;反應比例也不適合 07/27 23:36
4F：→ Ianthegood: 先看過protocol唄... 07/28 17:20
5F：→ storm780121: 我記得還有一罐鹽要加? 07/28 23:10
6F：→ a7225463: plate是新鮮的沒錯唷～ 另外，protocol上沒說PCR產物需 07/29 00:46
7F：→ a7225463: 要純化後再進行ligation所以沒純化，再來比例問題vector 07/29 00:46
8F：→ a7225463: 下的量是照protocol上寫的下，產物建議用量是0.5-1 ul 07/29 00:46
9F：→ a7225463: 所以我下1ul，不知道b大指的是哪邊有問題呢？ 如果我有 07/29 00:46
10F：→ a7225463: 哪邊認知錯誤歡迎告知唷！謝謝～ 07/29 00:46
11F：→ a90648: PCR產物裡面一堆雜七雜八的東西 07/29 00:54
12F：→ a90648: 直接拿去ligation 當然會接到一堆雜七雜八的東西囉!! 07/29 00:54
13F：→ blence: 既然原po也看protocol,應該也有看到pCR2.1用多少,時間多長 07/29 01:20
14F：→ blence: protocol也說你的band不是唯一或很乾淨,應該需要gel純化 07/29 01:28
15F：→ blence: vector不管2.1或II都建議用1ul,怎麼你的protocol會不同？ 07/29 01:46
16F：→ Ice9: PCR完的那一管很髒的，ligase 很脆弱。你應該先從很基本的原 07/29 11:33
17F：→ Ice9: 理(大致的)開始學，而不是一上來就用 kit，我覺得這是貴實驗 07/29 11:34
18F：→ Ice9: 的問題。另外，藍白篩會出錯很正常啊～～更何況你没純化產物 07/29 11:35
19F：→ blence: 原po用topo啦,不是普通人用ligase等級的 07/29 13:57
20F：→ Ice9: 唉，原PO抱歉了。感謝 blence 指正。 07/29 17:47
21F：推 jabari: 冰9也沒人說你錯啊...原po沒純化就上topo 接到雜的只能說t 07/29 21:54
22F：→ jabari: opo真的貴又強 什麼都能接 XD 試問: 皇帝豆跟小米粥哪 07/29 21:54
23F：→ jabari: 個比較好吞?? 要嘛我也吞小米粥(小雜band) 才不想吃皇 07/29 21:54
24F：→ jabari: 帝豆(目標產物) 噎死自己 07/29 21:54
25F：推 jabari: 而且...讓新手用topo的lab..說不定都用Phusion而不是普通T 07/29 21:56
26F：→ jabari: aq..原po沒說是用哪個 嗯... 07/29 21:56
27F：→ blence: 內文已經說Taq了,講Phusion會不會讓人誤會它是昂貴的Taq？ 07/30 00:30
28F：推 jabari: 也是 囧a 所以其實正確解是找售後?? 07/30 04:49
29F：→ xxtomnyxx: 老實說我覺得藍白挑是非常沒有效率的，原 PO 可以試試 07/30 12:16
30F：→ xxtomnyxx: colony PCR，可以不用一直抽 mini 就挑到有正確接上的 07/30 12:17
31F：→ xxtomnyxx: 菌。 07/30 12:17
32F：推 chaunen: 找個熟colony的一對一現場教學最快, 或直上他的protocol. 07/30 12:39
33F：推 ko363630: 藍白篩真的很沒效益,而且會有偽陽性的問題 07/30 15:16
34F：→ a7225463: 謝謝各位大大回答我的疑問～其實我的band P完之後是沒 07/31 01:06
35F：→ a7225463: 有雜band的，有也是在約3 kb的位置有很淡的ㄧ點點，但想 07/31 01:06
36F：→ a7225463: 說大的片段應該接不進去所以就沒純化了！不知道我的認 07/31 01:06
37F：→ a7225463: 知是否有誤？ 07/31 01:06
38F：→ a7225463: 謝謝cxtomnyxx大！你的colony PCR我會查一下並跟實驗室 07/31 01:08
39F：→ a7225463: 的學長姐討論看看的謝謝～ 07/31 01:08
40F：→ blence: 非常不建議做colonyPCR阿,它又不能解決偽陽性問題 07/31 01:56
41F：→ blence: 如果做cloning常失敗,應該是去改善成功率,降低偽陽性才對 07/31 01:57
42F：→ blence: 畢竟colonyPCR試完還是要mini,何必多此一舉又沒效益 07/31 02:13
43F：推 Ianthegood: colonyPCR就是大筆撒下去 理論上topo應該比較不需要吧 07/31 09:53