作者a7225463 (明智)
看板Biotech
标题[求救] TA cloning相关问题
时间Mon Jul 27 19:08:54 2015
我是借用朋友帐号po文的...谢谢
小妹我先用Taq p出我要的片段约650 np，然後照invitrogen的TOPO TA Cloning附的prot
ocol进行ligation:取1 ul的PCR产物及2 ul的pCR2.1 vector作用室温1 hr，接着做trans
formation用蓝白筛，结果有长白的colony也有蓝的，我挑白的做mini-prep再用EcoRI 切
我抽的DNA後，完全切不到我要的片段...就像insert根本没接进去ㄧ样...但没接进去的话c
olony的颜色怎麽会是白的勒？
所以我想请问各位大大 是否可以告知我是哪边实验出问题了勒？谢谢大家～
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 223.142.85.250
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1437995336.A.CF1.html
1F：推 jabari: 哪只Taq? 有纯化? 用了topo接不出来 经费表示伤心 07/27 21:16
2F：推 huuban: plat是新鲜的吗？ 07/27 22:09
3F：→ blence: 没照protocol时间;没纯化产物;反应比例也不适合 07/27 23:36
4F：→ Ianthegood: 先看过protocol呗... 07/28 17:20
5F：→ storm780121: 我记得还有一罐盐要加? 07/28 23:10
6F：→ a7225463: plate是新鲜的没错唷～ 另外，protocol上没说PCR产物需 07/29 00:46
7F：→ a7225463: 要纯化後再进行ligation所以没纯化，再来比例问题vector 07/29 00:46
8F：→ a7225463: 下的量是照protocol上写的下，产物建议用量是0.5-1 ul 07/29 00:46
9F：→ a7225463: 所以我下1ul，不知道b大指的是哪边有问题呢？ 如果我有 07/29 00:46
10F：→ a7225463: 哪边认知错误欢迎告知唷！谢谢～ 07/29 00:46
11F：→ a90648: PCR产物里面一堆杂七杂八的东西 07/29 00:54
12F：→ a90648: 直接拿去ligation 当然会接到一堆杂七杂八的东西罗!! 07/29 00:54
13F：→ blence: 既然原po也看protocol,应该也有看到pCR2.1用多少,时间多长 07/29 01:20
14F：→ blence: protocol也说你的band不是唯一或很乾净,应该需要gel纯化 07/29 01:28
15F：→ blence: vector不管2.1或II都建议用1ul,怎麽你的protocol会不同？ 07/29 01:46
16F：→ Ice9: PCR完的那一管很脏的，ligase 很脆弱。你应该先从很基本的原 07/29 11:33
17F：→ Ice9: 理(大致的)开始学，而不是一上来就用 kit，我觉得这是贵实验 07/29 11:34
18F：→ Ice9: 的问题。另外，蓝白筛会出错很正常啊～～更何况你没纯化产物 07/29 11:35
19F：→ blence: 原po用topo啦,不是普通人用ligase等级的 07/29 13:57
20F：→ Ice9: 唉，原PO抱歉了。感谢 blence 指正。 07/29 17:47
21F：推 jabari: 冰9也没人说你错啊...原po没纯化就上topo 接到杂的只能说t 07/29 21:54
22F：→ jabari: opo真的贵又强 什麽都能接 XD 试问: 皇帝豆跟小米粥哪 07/29 21:54
23F：→ jabari: 个比较好吞?? 要嘛我也吞小米粥(小杂band) 才不想吃皇 07/29 21:54
24F：→ jabari: 帝豆(目标产物) 噎死自己 07/29 21:54
25F：推 jabari: 而且...让新手用topo的lab..说不定都用Phusion而不是普通T 07/29 21:56
26F：→ jabari: aq..原po没说是用哪个 嗯... 07/29 21:56
27F：→ blence: 内文已经说Taq了,讲Phusion会不会让人误会它是昂贵的Taq？ 07/30 00:30
28F：推 jabari: 也是 囧a 所以其实正确解是找售後?? 07/30 04:49
29F：→ xxtomnyxx: 老实说我觉得蓝白挑是非常没有效率的，原 PO 可以试试 07/30 12:16
30F：→ xxtomnyxx: colony PCR，可以不用一直抽 mini 就挑到有正确接上的 07/30 12:17
31F：→ xxtomnyxx: 菌。 07/30 12:17
32F：推 chaunen: 找个熟colony的一对一现场教学最快, 或直上他的protocol. 07/30 12:39
33F：推 ko363630: 蓝白筛真的很没效益,而且会有伪阳性的问题 07/30 15:16
34F：→ a7225463: 谢谢各位大大回答我的疑问～其实我的band P完之後是没 07/31 01:06
35F：→ a7225463: 有杂band的，有也是在约3 kb的位置有很淡的ㄧ点点，但想 07/31 01:06
36F：→ a7225463: 说大的片段应该接不进去所以就没纯化了！不知道我的认 07/31 01:06
37F：→ a7225463: 知是否有误？ 07/31 01:06
38F：→ a7225463: 谢谢cxtomnyxx大！你的colony PCR我会查一下并跟实验室 07/31 01:08
39F：→ a7225463: 的学长姐讨论看看的谢谢～ 07/31 01:08
40F：→ blence: 非常不建议做colonyPCR阿,它又不能解决伪阳性问题 07/31 01:56
41F：→ blence: 如果做cloning常失败,应该是去改善成功率,降低伪阳性才对 07/31 01:57
42F：→ blence: 毕竟colonyPCR试完还是要mini,何必多此一举又没效益 07/31 02:13
43F：推 Ianthegood: colonyPCR就是大笔撒下去 理论上topo应该比较不需要吧 07/31 09:53