作者grassshan (紙飛機啊歐歐踢欸死)
看板Biotech
標題[求救] Western Hy抗體的步驟
時間Wed May 6 22:51:25 2015
先感謝板上AR大對於培養3T3-L1的寶貴建議～
我順利收下細胞最近在做Western Blot
但在Hy抗體的部分大卡關了～
除了reuse 的actin外
其他都一直失敗Q__Q
在猜步驟中可能錯誤的就是Hy抗體的地方了！（我有一次用reuse的PPAR gamma一抗有出現一條有點斜的Band)
我Hy 一抗是使用 5%PBST泡的脫脂奶
抗體跟奶的比例是1：1000
加的方法是先在方形小盒加入5ml 奶
先稍微在盒中晃勻，確定可以覆蓋盒底體積後
在盒中六個點分段加入抗體
（左上 ，中上，右上）
（左下，中下，右下）
加完後就利用Tip在盒底劃勻抗體
（左上斜紋劃到右下，
右上斜紋劃到左下，
上（下）橫紋劃到下（上），
左（右）縱紋劃到右（左））
我試過放4度C冰箱over night 跟一小時…
但都依舊很白Q__Q
二抗也是都一樣的方法，
actin 出來還蠻明顯的，
所以我在猜是不是我Hy一抗的步驟怎麼了？
請各位大大提出意見>_<～
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1F：→ blence: 有時間紀錄抗體怎麼mix,那一定有時間配在離心管vortex了 05/06 23:04
2F：→ blence: 這類的文章未看先猜,沒證據證明抗體有效 05/06 23:06
3F：→ grassshan: 學長一年前畢業買的抗體@_@ 05/07 00:27
4F：→ grassshan: 他的論文是跑出來有結果的 05/07 00:27
5F：→ grassshan: 我用reuse 有結果 05/07 00:27
6F：→ grassshan: 我自己加的沒結果 05/07 00:27
7F：→ grassshan: 所以我才懷疑是我的步驟問題… 05/07 00:27
8F：→ grassshan: votax的部分我在今天的實驗有試過但我只壓震約5秒就倒 05/07 00:27
9F：→ grassshan: 回盒子中，一樣是一片空白… 05/07 00:27
10F：推 tynse71864: 感覺就是抗體壞了 05/07 06:25
11F：→ grassshan: 抗體那麼容易壞了喔………… 05/07 13:21
12F：→ Ice9: 樓上，因為是 reused，所以應該是牛奶壞了導致的 05/07 16:41
13F：→ Ice9: 對不起，我眼斜了。他的 reused 没問題…… 05/07 16:42
14F：推 jabari: 抗體datasheet拿出來看一下 說不定是保存失當 05/07 18:11
15F：→ turtle24: 拿錯管或是原管壞了? 05/08 00:32
16F：推 ararthur: 我沒聽過這種加法耶 就直接load進盒子 讓他搖個幾分鐘 05/08 01:20
17F：→ ararthur: 應該就勻了阿 丟多少量的protein? 會否量太少染不到 act 05/08 01:21
18F：→ ararthur: 深嗎? 或許下次牛奶換成BSA 我常常BSA比牛奶染得出來 05/08 01:21
19F：→ wang987: 想問原po,用tip劃box的原因是？？ 05/08 11:43
20F：推 ararthur: 恨XD 05/08 12:24
21F：→ a90648: 我比較好奇加抗體的方式是自己發明的還是別人家教的XD 05/08 14:26
22F：→ grassshan: 沒拿錯管～這是實驗室流傳的加法 XD 說這樣比較勻… 05/08 18:59
23F：→ chvkimo: 我抗體加到牛奶裡面後 稍微混管子 然後就倒到膜上去了 05/09 16:18
24F：→ chvkimo: 放在shaker上搖一個小時 會不均勻嗎? 05/09 16:19
25F：→ chvkimo: 如果你要同時做6片 這樣混法 會花多久時間? 好奇 05/09 16:20