作者grassshan (纸飞机啊欧欧踢欸死)
看板Biotech
标题[求救] Western Hy抗体的步骤
时间Wed May 6 22:51:25 2015
先感谢板上AR大对於培养3T3-L1的宝贵建议～
我顺利收下细胞最近在做Western Blot
但在Hy抗体的部分大卡关了～
除了reuse 的actin外
其他都一直失败Q__Q
在猜步骤中可能错误的就是Hy抗体的地方了！（我有一次用reuse的PPAR gamma一抗有出现一条有点斜的Band)
我Hy 一抗是使用 5%PBST泡的脱脂奶
抗体跟奶的比例是1：1000
加的方法是先在方形小盒加入5ml 奶
先稍微在盒中晃匀，确定可以覆盖盒底体积後
在盒中六个点分段加入抗体
（左上 ，中上，右上）
（左下，中下，右下）
加完後就利用Tip在盒底划匀抗体
（左上斜纹划到右下，
右上斜纹划到左下，
上（下）横纹划到下（上），
左（右）纵纹划到右（左））
我试过放4度C冰箱over night 跟一小时…
但都依旧很白Q__Q
二抗也是都一样的方法，
actin 出来还蛮明显的，
所以我在猜是不是我Hy一抗的步骤怎麽了？
请各位大大提出意见>_<～
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1F：→ blence: 有时间纪录抗体怎麽mix,那一定有时间配在离心管vortex了 05/06 23:04
2F：→ blence: 这类的文章未看先猜,没证据证明抗体有效 05/06 23:06
3F：→ grassshan: 学长一年前毕业买的抗体@_@ 05/07 00:27
4F：→ grassshan: 他的论文是跑出来有结果的 05/07 00:27
5F：→ grassshan: 我用reuse 有结果 05/07 00:27
6F：→ grassshan: 我自己加的没结果 05/07 00:27
7F：→ grassshan: 所以我才怀疑是我的步骤问题… 05/07 00:27
8F：→ grassshan: votax的部分我在今天的实验有试过但我只压震约5秒就倒 05/07 00:27
9F：→ grassshan: 回盒子中，一样是一片空白… 05/07 00:27
10F：推 tynse71864: 感觉就是抗体坏了 05/07 06:25
11F：→ grassshan: 抗体那麽容易坏了喔………… 05/07 13:21
12F：→ Ice9: 楼上，因为是 reused，所以应该是牛奶坏了导致的 05/07 16:41
13F：→ Ice9: 对不起，我眼斜了。他的 reused 没问题…… 05/07 16:42
14F：推 jabari: 抗体datasheet拿出来看一下 说不定是保存失当 05/07 18:11
15F：→ turtle24: 拿错管或是原管坏了? 05/08 00:32
16F：推 ararthur: 我没听过这种加法耶 就直接load进盒子 让他摇个几分钟 05/08 01:20
17F：→ ararthur: 应该就匀了阿 丢多少量的protein? 会否量太少染不到 act 05/08 01:21
18F：→ ararthur: 深吗? 或许下次牛奶换成BSA 我常常BSA比牛奶染得出来 05/08 01:21
19F：→ wang987: 想问原po,用tip划box的原因是？？ 05/08 11:43
20F：推 ararthur: 恨XD 05/08 12:24
21F：→ a90648: 我比较好奇加抗体的方式是自己发明的还是别人家教的XD 05/08 14:26
22F：→ grassshan: 没拿错管～这是实验室流传的加法 XD 说这样比较匀… 05/08 18:59
23F：→ chvkimo: 我抗体加到牛奶里面後 稍微混管子 然後就倒到膜上去了 05/09 16:18
24F：→ chvkimo: 放在shaker上摇一个小时 会不均匀吗? 05/09 16:19
25F：→ chvkimo: 如果你要同时做6片 这样混法 会花多久时间? 好奇 05/09 16:20