作者simoncharlie (Caramel Waffle)
看板Biotech
標題[求救] Real-time PCR的Ct值和螢光強度
時間Wed Apr 29 15:38:19 2015
各位前輩們好
最近我用cDNA做real-time PCR
但手邊兩組設計位置相差不遠的primers及probes (組A, 組B)
實驗結果(一次只加一組) Ct值十分接近 但45個cycles後
螢光值卻差了兩倍 (A組是B組兩倍)
雖說定量只會用到ct值
但我實在不知道哪一組比較適合
且也不知道為什麼會發生這種事QQ
我還設計了C組primers/probes 在同基因但離較遠的地方
其實驗結果Ct值和螢光都與A組較接近
希望前輩們幫忙解惑 感激不盡!
不知道A組或B組誰較適合 或都可以 ><
若需要補上什麼細節也請告訴我 謝謝(*?>д<)
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 42.78.252.120
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※ 編輯: simoncharlie (42.78.252.120), 04/29/2015 15:54:35
1F：推 jabari: 45 cycles後的東西準嗎奇??04/29 16:10
2F：推 caesar0926: melting curve呢??04/29 16:16
3F：→ caesar0926: 現在的機器應該會autobaseline吧??且太多cycle也不行.04/29 16:18
4F：推 dirkwen: 沒記錯，大於33個cycle後比較沒意義了04/29 17:05
沒有做melting curve @@
兩組都是隨cycles數 螢光值有著漂亮的s型(倒)上升曲線 但一個s比較高 一個比較低
但沒注意33cycles以前是不是profile一樣@@ 晚點來看看 :)
※ 編輯: simoncharlie (42.70.80.232), 04/29/2015 17:24:34
5F：→ a90648: 附個圖吧!! 基本上45cycle後的東西不用管了啦 04/29 17:24
6F：→ a90648: 測試primer melting curve 一定要做 04/29 17:25
7F：→ a90648: 不然不知道primer專一性如何 04/29 17:26
8F：→ a90648: 沒注意，你是用taqman system的話就還好@@ 04/29 17:29
9F：推 chaunen: 所以可能只是A,B組primer在PCR效率上的差異囉? 04/29 18:15
10F：推 jabari: probe不用melting啦 可是45cycle的話quencher應該也掉了XD 04/29 19:44
11F：→ Ice9: 真不不要在意 45 cycles 之後的事情了。就連 35 cycles 前若 04/29 19:52
12F：→ Ice9: 是 curve 不美，我都要抓頭了。 04/29 19:54
圖來了! 怎麼辦 好像長得不太一樣QQ!
http://ppt.cc/7cgH
三重複 所以有九條線
比較高的六條 就是A和C組primers/probes 的結果
比較低的三條就是B組
用來算Ct值得那條橫線(baseline threshold) 是軟體拉的
九條線都落在 15 +- 0.25 @@
※ 編輯: simoncharlie (118.160.113.18), 04/29/2015 21:39:44
13F：→ Ice9: 很漂亮的圖啊。你只要看 30 甚至是 20 cycles 之前的就可以 04/29 22:55
14F：→ Ice9: 我還覺得，就 primers 而言，B組在 16 cycles 前就比A或C其 04/29 22:56
15F：→ Ice9: 中之一還『敏感』。我大概會選B組來做。 04/29 23:01
16F：→ simoncharlie: 請問怎麼看得出"敏感"呢?! 04/29 23:22
17F：推 supray: plateau的螢光值跟你的amplicon size有關 04/30 12:48
18F：→ supray: 多少莫耳數 最多就只能轉出多少產物 04/30 12:50
19F：→ supray: ^primer 是限制試劑 04/30 12:51
20F：→ supray: 同莫耳數 片段大的螢光比較強 04/30 12:52
21F：→ supray: 以上對sybr的qPCR來說 04/30 12:55
22F：→ supray: taqman probe 的 我覺得變異更大 04/30 12:56
23F：推 jabari: -.,- 沒差 04/30 21:30
24F：推 jabari: 原po這個 其實跟probe效率比較有關 而且跟螢光組合也有關 04/30 21:33
25F：→ jabari: 係 更甚者 如樓上大大說的 primer夾的效率也有關係 04/30 21:33