作者simoncharlie (Caramel Waffle)
看板Biotech
标题[求救] Real-time PCR的Ct值和萤光强度
时间Wed Apr 29 15:38:19 2015
各位前辈们好
最近我用cDNA做real-time PCR
但手边两组设计位置相差不远的primers及probes (组A, 组B)
实验结果(一次只加一组) Ct值十分接近 但45个cycles後
萤光值却差了两倍 (A组是B组两倍)
虽说定量只会用到ct值
但我实在不知道哪一组比较适合
且也不知道为什麽会发生这种事QQ
我还设计了C组primers/probes 在同基因但离较远的地方
其实验结果Ct值和萤光都与A组较接近
希望前辈们帮忙解惑 感激不尽!
不知道A组或B组谁较适合 或都可以 ><
若需要补上什麽细节也请告诉我 谢谢(*?>д<)
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※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc), 来自: 42.78.252.120
※ 文章网址: https://webptt.com/cn.aspx?n=bbs/Biotech/M.1430293102.A.5C7.html
※ 编辑: simoncharlie (42.78.252.120), 04/29/2015 15:54:35
1F：推 jabari: 45 cycles後的东西准吗奇??04/29 16:10
2F：推 caesar0926: melting curve呢??04/29 16:16
3F：→ caesar0926: 现在的机器应该会autobaseline吧??且太多cycle也不行.04/29 16:18
4F：推 dirkwen: 没记错，大於33个cycle後比较没意义了04/29 17:05
没有做melting curve @@
两组都是随cycles数 萤光值有着漂亮的s型(倒)上升曲线 但一个s比较高 一个比较低
但没注意33cycles以前是不是profile一样@@ 晚点来看看 :)
※ 编辑: simoncharlie (42.70.80.232), 04/29/2015 17:24:34
5F：→ a90648: 附个图吧!! 基本上45cycle後的东西不用管了啦 04/29 17:24
6F：→ a90648: 测试primer melting curve 一定要做 04/29 17:25
7F：→ a90648: 不然不知道primer专一性如何 04/29 17:26
8F：→ a90648: 没注意，你是用taqman system的话就还好@@ 04/29 17:29
9F：推 chaunen: 所以可能只是A,B组primer在PCR效率上的差异罗? 04/29 18:15
10F：推 jabari: probe不用melting啦 可是45cycle的话quencher应该也掉了XD 04/29 19:44
11F：→ Ice9: 真不不要在意 45 cycles 之後的事情了。就连 35 cycles 前若 04/29 19:52
12F：→ Ice9: 是 curve 不美，我都要抓头了。 04/29 19:54
图来了! 怎麽办 好像长得不太一样QQ!
http://ppt.cc/7cgH
三重复 所以有九条线
比较高的六条 就是A和C组primers/probes 的结果
比较低的三条就是B组
用来算Ct值得那条横线(baseline threshold) 是软体拉的
九条线都落在 15 +- 0.25 @@
※ 编辑: simoncharlie (118.160.113.18), 04/29/2015 21:39:44
13F：→ Ice9: 很漂亮的图啊。你只要看 30 甚至是 20 cycles 之前的就可以 04/29 22:55
14F：→ Ice9: 我还觉得，就 primers 而言，B组在 16 cycles 前就比A或C其 04/29 22:56
15F：→ Ice9: 中之一还『敏感』。我大概会选B组来做。 04/29 23:01
16F：→ simoncharlie: 请问怎麽看得出"敏感"呢?! 04/29 23:22
17F：推 supray: plateau的萤光值跟你的amplicon size有关 04/30 12:48
18F：→ supray: 多少莫耳数 最多就只能转出多少产物 04/30 12:50
19F：→ supray: ^primer 是限制试剂 04/30 12:51
20F：→ supray: 同莫耳数 片段大的萤光比较强 04/30 12:52
21F：→ supray: 以上对sybr的qPCR来说 04/30 12:55
22F：→ supray: taqman probe 的 我觉得变异更大 04/30 12:56
23F：推 jabari: -.,- 没差 04/30 21:30
24F：推 jabari: 原po这个 其实跟probe效率比较有关 而且跟萤光组合也有关 04/30 21:33
25F：→ jabari: 系 更甚者 如楼上大大说的 primer夹的效率也有关系 04/30 21:33