作者storm780121 (魚頭)
看板Biotech
標題[求救] promoter的PCR
時間Sat Apr 25 23:04:26 2015
各位前輩好
最近小弟在PCR一段promoter並預計construct在reporter gene前測試表現狀況
但是在PCR就卡關.....
目前設計了幾組primer
A promoter B ORF C
I========================I-----------I
F1 R1 R2 R3
F=forward primer
R=reverse primer
A位置的primer Tm約56度 GC比約50幾趴 約20出頭個mer 感覺還好
B位置問題就出現了 GC比超高 但是又非B位置不可
因此我設計了R1 R2兩支primer
R1:Tm約63度 GC比快70% 而且有60幾度的hairpin存在
R2:Tm約55度 GC比100% 不過沒有二級結構
R3:Tm約56度 GC比約60% 也沒有二級結構
預防R1 R2 P不出來 所以想說用R3從genomic中把整段都P出來 可以當作R1 R2的模板
結果就是R1 R2 R3通通都P不出來.........
PCR條件基本上是:
94度都設定45秒
72度都設定1分15秒 (目標約2.2k 先用1k/30sec的酵素測試primer)
都跑25 cycle
annealing設定過55、60、65度、先55度10 cycle 63度15 cycle
以及 先63度10 cycle再換55度15 cycle
而taq的部分使用過一般的taq以及HiFi DNA Polymerase (包含測試內附之A B兩種buf.)
樣本使用kit抽取之genomic DNA 測試過 30ng 3ng 0.3ng 進行反應
並分別測試過不加/加 2.5% 5% 10% DMSO 或是 5% glycerol
經過以上排列組合 結果通通smear (....)
接著再用F1R3的smear產物稀釋10x用F1R1 F1R2做PCR
(這部分僅以taq測試 annealing 55度 以及 0% 2.5% 5% DMSO)
結果在smear藏有淡淡的band 可惜大小差太多 不能切膠跟他尬 (..........)
講到這邊先感謝前輩把整篇看完
在這邊想請問小弟在哪些條件/配方/設定可能需要再修正的呢?
謝謝大家!!
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※ 編輯: storm780121 (36.236.246.85), 04/25/2015 23:09:20
1F：→ Ice9: control 呢？非目標 DNA，但用以測試 PCR condition 甚至是 04/25 23:38
2F：→ Ice9: DNA quality 的目標 PCR 產物，如 GAPDH 之類的。有同時測試 04/25 23:39
3F：→ Ice9: 嗎？另外，除了 DMSO，可以考慮 betaine (1~2M)，[Mg](1-2M) 04/25 23:43
4F：→ Ice9: 第一次的 94℃ 是多久？ dNTP 濃度是多少？(可以考慮加多點) 04/25 23:46
5F：→ Ice9: R2 可以考慮先用旁邊的適當位置，待construct完後，再用類似 04/25 23:48
6F：→ Ice9: site-directed mutagenesis PCR 的方式以 primer 修正序列。 04/25 23:49
7F：→ Ice9: 另外，可以測試用 32 或 35 個 cycles，看看有無東西。 04/25 23:50
control 原本要用GAPDH 只是做之前手殘 primer掉地上我就找不到他了 (....)
等等來重訂一隻好了
第一次94度是5分鐘 dNTP濃度final約0.18 mM (3mM stock取1.5 ul 最終25ul)
明天我再用您建議的方式再測試看看 謝謝您
※ 編輯: storm780121 (36.236.246.85), 04/26/2015 00:37:54
※ 編輯: storm780121 (36.236.246.85), 04/26/2015 00:40:06
8F：推 Ianthegood: tm再降啊 從48開始試 04/26 09:18
9F：→ stone1105: 如果是我，我會跑長一點的cycle，然後跑個gradient 04/26 17:14
10F：推 chaunen: p完覺得弱 可以再拿1ul p第二次阿 04/26 23:28
11F：→ huuban: 如果最後成功了，記得把方法寫上來啊XD 04/27 10:30
12F：推 jimmy80727: 有沒有house keeping gene 可以測DNA品質和濃度? 05/29 16:40
13F：推 windyflyer: 我...我當初是從中間剛好有酵素切位分兩半再接起來 07/30 23:20
14F：→ windyflyer: 然後才發現後面沒問題 問題出在前半 最後前半用合成 07/30 23:21
15F：→ satasumi: F+R3 94 5'+94 1' 54 1' 72 2'30" *35 +72 5' + 4_____ 09/20 08:02