作者storm780121 (鱼头)
看板Biotech
标题[求救] promoter的PCR
时间Sat Apr 25 23:04:26 2015
各位前辈好
最近小弟在PCR一段promoter并预计construct在reporter gene前测试表现状况
但是在PCR就卡关.....
目前设计了几组primer
A promoter B ORF C
I========================I-----------I
F1 R1 R2 R3
F=forward primer
R=reverse primer
A位置的primer Tm约56度 GC比约50几趴 约20出头个mer 感觉还好
B位置问题就出现了 GC比超高 但是又非B位置不可
因此我设计了R1 R2两支primer
R1:Tm约63度 GC比快70% 而且有60几度的hairpin存在
R2:Tm约55度 GC比100% 不过没有二级结构
R3:Tm约56度 GC比约60% 也没有二级结构
预防R1 R2 P不出来 所以想说用R3从genomic中把整段都P出来 可以当作R1 R2的模板
结果就是R1 R2 R3通通都P不出来.........
PCR条件基本上是:
94度都设定45秒
72度都设定1分15秒 (目标约2.2k 先用1k/30sec的酵素测试primer)
都跑25 cycle
annealing设定过55、60、65度、先55度10 cycle 63度15 cycle
以及 先63度10 cycle再换55度15 cycle
而taq的部分使用过一般的taq以及HiFi DNA Polymerase (包含测试内附之A B两种buf.)
样本使用kit抽取之genomic DNA 测试过 30ng 3ng 0.3ng 进行反应
并分别测试过不加/加 2.5% 5% 10% DMSO 或是 5% glycerol
经过以上排列组合 结果通通smear (....)
接着再用F1R3的smear产物稀释10x用F1R1 F1R2做PCR
(这部分仅以taq测试 annealing 55度 以及 0% 2.5% 5% DMSO)
结果在smear藏有淡淡的band 可惜大小差太多 不能切胶跟他尬 (..........)
讲到这边先感谢前辈把整篇看完
在这边想请问小弟在哪些条件/配方/设定可能需要再修正的呢?
谢谢大家!!
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※ 编辑: storm780121 (36.236.246.85), 04/25/2015 23:09:20
1F：→ Ice9: control 呢？非目标 DNA，但用以测试 PCR condition 甚至是 04/25 23:38
2F：→ Ice9: DNA quality 的目标 PCR 产物，如 GAPDH 之类的。有同时测试 04/25 23:39
3F：→ Ice9: 吗？另外，除了 DMSO，可以考虑 betaine (1~2M)，[Mg](1-2M) 04/25 23:43
4F：→ Ice9: 第一次的 94℃ 是多久？ dNTP 浓度是多少？(可以考虑加多点) 04/25 23:46
5F：→ Ice9: R2 可以考虑先用旁边的适当位置，待construct完後，再用类似 04/25 23:48
6F：→ Ice9: site-directed mutagenesis PCR 的方式以 primer 修正序列。 04/25 23:49
7F：→ Ice9: 另外，可以测试用 32 或 35 个 cycles，看看有无东西。 04/25 23:50
control 原本要用GAPDH 只是做之前手残 primer掉地上我就找不到他了 (....)
等等来重订一只好了
第一次94度是5分钟 dNTP浓度final约0.18 mM (3mM stock取1.5 ul 最终25ul)
明天我再用您建议的方式再测试看看 谢谢您
※ 编辑: storm780121 (36.236.246.85), 04/26/2015 00:37:54
※ 编辑: storm780121 (36.236.246.85), 04/26/2015 00:40:06
8F：推 Ianthegood: tm再降啊 从48开始试 04/26 09:18
9F：→ stone1105: 如果是我，我会跑长一点的cycle，然後跑个gradient 04/26 17:14
10F：推 chaunen: p完觉得弱 可以再拿1ul p第二次阿 04/26 23:28
11F：→ huuban: 如果最後成功了，记得把方法写上来啊XD 04/27 10:30
12F：推 jimmy80727: 有没有house keeping gene 可以测DNA品质和浓度? 05/29 16:40
13F：推 windyflyer: 我...我当初是从中间刚好有酵素切位分两半再接起来 07/30 23:20
14F：→ windyflyer: 然後才发现後面没问题 问题出在前半 最後前半用合成 07/30 23:21
15F：→ satasumi: F+R3 94 5'+94 1' 54 1' 72 2'30" *35 +72 5' + 4_____ 09/20 08:02