作者eric1210 (打狗)
看板Biotech
標題[求救] Supercoil form plasmid 電泳問題
時間Fri Apr 24 17:31:51 2015
大家好 ，最近接了一個案子
要跑supercoil DNA plasmid電泳
分成 直接
loading plasmid （supercoil form）
enzyme digest成為open-circular form
enzyme digest成linear form
根據datasheet
SC跑最下面 ，OC較高 ，LC略比OC高
可是我跑出來 ，SC,OC沒問題
但LC卻比SC還低
另外包括marker,band都不清楚
但很粗 ，所以應該不是loading量問題
可能在於染色 ，
是用EtBr代染劑染的
聽說用不同染劑可能會因此跑出不同大小？？
匯整問道為：
1. LC位置過低可能造成因素
2. band不明顯是染劑問題？（如果跑膠時間很長會有影響嗎）
3. 不同染劑可能造成位置差異？
4. supercoil marker位置與1 kb marker
完全不同 ，該相信誰
謝謝各位
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1F：推 jabari: 切位只有單切嗎? 另外把sc取一些用力pippette04/24 17:50
2F：→ jabari: 外力動能應該就能造成oc了04/24 17:51
3F：→ eric1210: OC是用enzyme單切一股沒錯 ，是nick04/24 18:04
4F：→ blence: 我用一般的safe dye的確跟EtBr會有不同04/24 22:09
5F：→ blence: 只是你有放ref? 怎麼知道是OC比SC低,還是SCOCLC都變低?04/24 22:12
6F：→ Ianthegood: 外染啊04/25 09:03
7F：→ eric1210: 目前打算外染 ，至於高度是有資料的 ，算是有ref04/26 18:07
8F：→ blence: 既然是SC,就不是以size區別的,光憑高度怎知是SC04/26 19:37
9F：→ blence: SCLCOC常以整體分布最下面認定是SC,而不是精確位置吧阿04/26 19:41
10F：→ eric1210: 好的 ，因為以前沒接觸過 ，謝謝你04/27 00:16
※ 編輯: eric1210 (118.166.153.149), 04/27/2015 00:18:40
11F：→ eric1210: 我發現我打錯字 ，有問題是LC，他比SC還低 ，要再確認 04/27 00:19
12F：→ Ice9: LC 是簡寫？那個 C 是打哪兒來的？ 04/27 20:50
13F：→ Ice9: 外染的位置才會正確，你內染了，SC 都很難形成單一相吧？ 04/27 20:51
14F：→ Ice9: 一般外染時，linear form 的位置一定是固定的，絕一可能比SC 04/27 21:00
15F：→ Ice9: 還低。光看 gel，你要如何確定 linear 比 SC 低？而比 SC 低 04/27 21:02
16F：→ Ice9: 的就一定是你認為的 linear form? 04/27 21:03
17F：→ eric1210: 現在外染後 ，linear form還是比SC，因為我沒有map 04/27 22:18
18F：→ eric1210: 所以不知道是否切兩刀以上 ，其他小片段沒看到了 04/27 22:18
19F：→ blence: 我懷疑溝通不良？ 你如何從multi-band知道哪個是SC? 04/27 22:20
20F：→ eric1210: 比SC低是在同一塊gel上的相對位置，至於我沒有map 04/27 22:20
21F：→ eric1210: 所以是參考data sheet的 ，根據data sheet最低的是SC 04/27 22:21
22F：→ eric1210: 阿 ，是single band,SC OC linear form分別在三個不同la 04/27 22:22
23F：→ eric1210: ne 04/27 22:22
24F：→ blence: 既然最低的是SC,就不會LF有比SC還低的問題阿 04/27 22:24
25F：→ eric1210: SC => 僅loading plasmid. OC=>loading切一個nick的plas 04/27 22:25
26F：→ eric1210: mid. linear form=> loading 切成linear form的plasmid. 04/27 22:25
27F：→ blence: 如果你看到LF比SC還低,就有可能SC不是如你認為的 04/27 22:25
28F：→ blence: 當然,你說的two cut也可能造成上面的困擾就是 04/27 22:26
29F：→ eric1210: 對 ，可是那是data sheet,我自己跑出來最低的是LF 04/27 22:26
30F：→ blence: 不過當你說僅load p就是SC其實是有問題的,因為SC應該以比 04/27 22:28
31F：→ blence: LF的結果才能判定,畢竟uncut不必都以SC存在 04/27 22:28
32F：→ eric1210: 所以一般來說, 如果LF 是one cut,SC會比LF低才對? 04/27 22:30
33F：→ eric1210: 這方面我真的不了解@@ 抱歉 plasmid是sponsor給的 04/27 22:31
34F：→ eric1210: 所以可能我認為的SC實質上不是SC? 04/27 22:32
35F：→ eric1210: 因為根據我的了解,SC應該會最快,OC第二,LF最慢 04/27 22:36
36F：→ eric1210: data sheet也是如此,但我拿做data的同一管LF來跑 04/27 22:37
37F：→ eric1210: 結果就是不一樣,自己重新digestion也沒改變 04/27 22:38
38F：→ eric1210: 也不知道是因為LF有兩個以上cut,還是我電泳問題 04/27 22:39
39F：→ eric1210: 還是染色問題,還是根本就是SC本身不是SC 04/27 22:40
40F：→ eric1210: 有查到資料是寫電泳速率 SC>LC>OC 混亂了... 04/27 22:46
41F：→ blence: 我參考的也是SC-LF-OC,所以當疑似的SC比linear還慢,會先懷 04/27 23:08
42F：→ blence: 疑可能不是SC,或是linear有誤,而不會真的認定SC比較高 04/27 23:09
43F：→ eric1210: 那我先朝SC linear這方面去探討好了,因為map是對方機密 04/27 23:18
44F：→ eric1210: 所以要去看看是不是有two cut可能只能用高%gel跑 04/27 23:18
45F：→ eric1210: 看有沒有看到其他小片段,SC要如何確認就沒概念了 04/27 23:19
46F：→ eric1210: 無論如何還是謝謝你 04/27 23:19
47F：→ Ice9: 基本上，plasmid 不是自己 prepared，我都深深懷疑其完整性. 04/28 01:22
48F：→ Ice9: 過程中很容易形成一堆OC。map是機密，那跑膠圖應該不是吧？ 04/28 01:23
49F：→ Ice9: 可以秀一下比較圖嗎？ 04/28 01:24