作者eric1210 (打狗)
看板Biotech
标题[求救] Supercoil form plasmid 电泳问题
时间Fri Apr 24 17:31:51 2015
大家好 ，最近接了一个案子
要跑supercoil DNA plasmid电泳
分成 直接
loading plasmid （supercoil form）
enzyme digest成为open-circular form
enzyme digest成linear form
根据datasheet
SC跑最下面 ，OC较高 ，LC略比OC高
可是我跑出来 ，SC,OC没问题
但LC却比SC还低
另外包括marker,band都不清楚
但很粗 ，所以应该不是loading量问题
可能在於染色 ，
是用EtBr代染剂染的
听说用不同染剂可能会因此跑出不同大小？？
汇整问道为：
1. LC位置过低可能造成因素
2. band不明显是染剂问题？（如果跑胶时间很长会有影响吗）
3. 不同染剂可能造成位置差异？
4. supercoil marker位置与1 kb marker
完全不同 ，该相信谁
谢谢各位
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1F：推 jabari: 切位只有单切吗? 另外把sc取一些用力pippette04/24 17:50
2F：→ jabari: 外力动能应该就能造成oc了04/24 17:51
3F：→ eric1210: OC是用enzyme单切一股没错 ，是nick04/24 18:04
4F：→ blence: 我用一般的safe dye的确跟EtBr会有不同04/24 22:09
5F：→ blence: 只是你有放ref? 怎麽知道是OC比SC低,还是SCOCLC都变低?04/24 22:12
6F：→ Ianthegood: 外染啊04/25 09:03
7F：→ eric1210: 目前打算外染 ，至於高度是有资料的 ，算是有ref04/26 18:07
8F：→ blence: 既然是SC,就不是以size区别的,光凭高度怎知是SC04/26 19:37
9F：→ blence: SCLCOC常以整体分布最下面认定是SC,而不是精确位置吧阿04/26 19:41
10F：→ eric1210: 好的 ，因为以前没接触过 ，谢谢你04/27 00:16
※ 编辑: eric1210 (118.166.153.149), 04/27/2015 00:18:40
11F：→ eric1210: 我发现我打错字 ，有问题是LC，他比SC还低 ，要再确认 04/27 00:19
12F：→ Ice9: LC 是简写？那个 C 是打哪儿来的？ 04/27 20:50
13F：→ Ice9: 外染的位置才会正确，你内染了，SC 都很难形成单一相吧？ 04/27 20:51
14F：→ Ice9: 一般外染时，linear form 的位置一定是固定的，绝一可能比SC 04/27 21:00
15F：→ Ice9: 还低。光看 gel，你要如何确定 linear 比 SC 低？而比 SC 低 04/27 21:02
16F：→ Ice9: 的就一定是你认为的 linear form? 04/27 21:03
17F：→ eric1210: 现在外染後 ，linear form还是比SC，因为我没有map 04/27 22:18
18F：→ eric1210: 所以不知道是否切两刀以上 ，其他小片段没看到了 04/27 22:18
19F：→ blence: 我怀疑沟通不良？ 你如何从multi-band知道哪个是SC? 04/27 22:20
20F：→ eric1210: 比SC低是在同一块gel上的相对位置，至於我没有map 04/27 22:20
21F：→ eric1210: 所以是参考data sheet的 ，根据data sheet最低的是SC 04/27 22:21
22F：→ eric1210: 阿 ，是single band,SC OC linear form分别在三个不同la 04/27 22:22
23F：→ eric1210: ne 04/27 22:22
24F：→ blence: 既然最低的是SC,就不会LF有比SC还低的问题阿 04/27 22:24
25F：→ eric1210: SC => 仅loading plasmid. OC=>loading切一个nick的plas 04/27 22:25
26F：→ eric1210: mid. linear form=> loading 切成linear form的plasmid. 04/27 22:25
27F：→ blence: 如果你看到LF比SC还低,就有可能SC不是如你认为的 04/27 22:25
28F：→ blence: 当然,你说的two cut也可能造成上面的困扰就是 04/27 22:26
29F：→ eric1210: 对 ，可是那是data sheet,我自己跑出来最低的是LF 04/27 22:26
30F：→ blence: 不过当你说仅load p就是SC其实是有问题的,因为SC应该以比 04/27 22:28
31F：→ blence: LF的结果才能判定,毕竟uncut不必都以SC存在 04/27 22:28
32F：→ eric1210: 所以一般来说, 如果LF 是one cut,SC会比LF低才对? 04/27 22:30
33F：→ eric1210: 这方面我真的不了解@@ 抱歉 plasmid是sponsor给的 04/27 22:31
34F：→ eric1210: 所以可能我认为的SC实质上不是SC? 04/27 22:32
35F：→ eric1210: 因为根据我的了解,SC应该会最快,OC第二,LF最慢 04/27 22:36
36F：→ eric1210: data sheet也是如此,但我拿做data的同一管LF来跑 04/27 22:37
37F：→ eric1210: 结果就是不一样,自己重新digestion也没改变 04/27 22:38
38F：→ eric1210: 也不知道是因为LF有两个以上cut,还是我电泳问题 04/27 22:39
39F：→ eric1210: 还是染色问题,还是根本就是SC本身不是SC 04/27 22:40
40F：→ eric1210: 有查到资料是写电泳速率 SC>LC>OC 混乱了... 04/27 22:46
41F：→ blence: 我参考的也是SC-LF-OC,所以当疑似的SC比linear还慢,会先怀 04/27 23:08
42F：→ blence: 疑可能不是SC,或是linear有误,而不会真的认定SC比较高 04/27 23:09
43F：→ eric1210: 那我先朝SC linear这方面去探讨好了,因为map是对方机密 04/27 23:18
44F：→ eric1210: 所以要去看看是不是有two cut可能只能用高%gel跑 04/27 23:18
45F：→ eric1210: 看有没有看到其他小片段,SC要如何确认就没概念了 04/27 23:19
46F：→ eric1210: 无论如何还是谢谢你 04/27 23:19
47F：→ Ice9: 基本上，plasmid 不是自己 prepared，我都深深怀疑其完整性. 04/28 01:22
48F：→ Ice9: 过程中很容易形成一堆OC。map是机密，那跑胶图应该不是吧？ 04/28 01:23
49F：→ Ice9: 可以秀一下比较图吗？ 04/28 01:24