作者kgwu (徵5/2 獅象戰內野優待票)
看板Biotech
標題[求救] cDNA取量問題(Realtime PCR)
時間Mon Apr 20 11:23:01 2015
這問題可能有點基礎
不過小弟第一次做realtime PCR
因此還是發文請教了...
RNA轉cDNA步驟:
假設我有A，B兩個sample
A sample: 1ug RNA要取0.38 ul
B sample: 1ug RNA要取0.72 ul
轉cDNA的時候我就取A sample 0.38ul和B sample 0.72ul
也就是各取1ug的RNA去轉cDNA
這樣我要上機做Realtime PCR之前
cDNA要再做一次定量嗎?
還是我A sample和B sample的cDNA不用定量，直接取1ul就會取到相同的量?
請版友不吝指教了 謝謝!
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1F：推 lail: 我cDNA沒再定量，但跑resl-time PCR時會跑internal control 04/20 11:28
2F：→ lail: ，理論上二樣本所得之值不會差太多 04/20 11:28
3F：→ blence: 轉完RT的cDNA很難精準定量 04/20 12:06
4F：→ supray: 轉完RT的cDNA通常不會純化,就直接做qPCR,所以不會定量 04/20 12:51
5F：→ supray: 沒純化過,定量沒有意義 04/20 12:52
6F：推 jabari: 有reference就不用定量啦 ... 都是比2-△△CT 04/20 14:50
7F：→ kgwu: 感謝大家的回覆! 04/20 15:52
8F：推 as862437: cDNA 不用定量？會不會每一體積濃度差很多造成 ref cycl 04/21 01:32
9F：→ as862437: e數差很多？ 04/21 01:32
10F：→ a90648: 轉RT時RNA一定會定量啊!!理論上等量RNA轉出來的cDNA量 04/21 12:19
11F：→ a90648: 這在internal control的Ct值就看得出來，如果差很多 04/21 12:20
12F：→ a90648: 反而要注意這麼大的誤差是怎麼來的 04/21 12:20
13F：→ a90648: 等量RNA轉出來的cDNA量應該差不多 04/21 12:21
14F：→ as862437: 謝謝樓上 解惑ㄌ 04/21 13:44
15F：→ as862437: ^了 04/21 13:44
16F：→ Ice9: 用 pipetman 取 1.0 ul 以下的東西，你覺得這樣會夠精準嗎？ 04/24 01:59
17F：→ Ice9: 還不如相信 qPCR 做的 internal control。 04/24 01:59
18F：推 shinchenboy: 我RNA萃完就會先定量再轉成cDNA 05/02 12:20
19F：推 shinchenboy: 轉成cDNA後就直接做PCR 05/02 12:21
20F：→ shinchenboy: 不用再定量一次 05/02 12:21