作者kgwu (徵5/2 狮象战内野优待票)
看板Biotech
标题[求救] cDNA取量问题(Realtime PCR)
时间Mon Apr 20 11:23:01 2015
这问题可能有点基础
不过小弟第一次做realtime PCR
因此还是发文请教了...
RNA转cDNA步骤:
假设我有A，B两个sample
A sample: 1ug RNA要取0.38 ul
B sample: 1ug RNA要取0.72 ul
转cDNA的时候我就取A sample 0.38ul和B sample 0.72ul
也就是各取1ug的RNA去转cDNA
这样我要上机做Realtime PCR之前
cDNA要再做一次定量吗?
还是我A sample和B sample的cDNA不用定量，直接取1ul就会取到相同的量?
请版友不吝指教了 谢谢!
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1F：推 lail: 我cDNA没再定量，但跑resl-time PCR时会跑internal control 04/20 11:28
2F：→ lail: ，理论上二样本所得之值不会差太多 04/20 11:28
3F：→ blence: 转完RT的cDNA很难精准定量 04/20 12:06
4F：→ supray: 转完RT的cDNA通常不会纯化,就直接做qPCR,所以不会定量 04/20 12:51
5F：→ supray: 没纯化过,定量没有意义 04/20 12:52
6F：推 jabari: 有reference就不用定量啦 ... 都是比2-△△CT 04/20 14:50
7F：→ kgwu: 感谢大家的回覆! 04/20 15:52
8F：推 as862437: cDNA 不用定量？会不会每一体积浓度差很多造成 ref cycl 04/21 01:32
9F：→ as862437: e数差很多？ 04/21 01:32
10F：→ a90648: 转RT时RNA一定会定量啊!!理论上等量RNA转出来的cDNA量 04/21 12:19
11F：→ a90648: 这在internal control的Ct值就看得出来，如果差很多 04/21 12:20
12F：→ a90648: 反而要注意这麽大的误差是怎麽来的 04/21 12:20
13F：→ a90648: 等量RNA转出来的cDNA量应该差不多 04/21 12:21
14F：→ as862437: 谢谢楼上 解惑ㄌ 04/21 13:44
15F：→ as862437: ^了 04/21 13:44
16F：→ Ice9: 用 pipetman 取 1.0 ul 以下的东西，你觉得这样会够精准吗？ 04/24 01:59
17F：→ Ice9: 还不如相信 qPCR 做的 internal control。 04/24 01:59
18F：推 shinchenboy: 我RNA萃完就会先定量再转成cDNA 05/02 12:20
19F：推 shinchenboy: 转成cDNA後就直接做PCR 05/02 12:21
20F：→ shinchenboy: 不用再定量一次 05/02 12:21