作者ducky313 (Lara)
看板Biotech
標題[求救] TRIZOL 抽 RNA的pellet形狀
時間Fri Apr 17 21:16:10 2015
想請教大家幾個關於用TRIZOL抽RNA的問題..
步驟大致上都是照著說明書上的進行
收集sample時 TRIZOL加 750 ul
chloroform 加 200 ul後 搖晃混濁靜置 3-5 分鐘後離心
接著抽取水層上清液 水層大概是有 400 ul
我只取了 100 ul或200 ul 加入400ul的isopropanol，搖晃混濁靜置10mins後離心
第一個問題是
在離心後會出現RNA pellet 說明書上寫的是"gel-like"pellet
而我出現了兩種
只取100ul的是gel-like半透明的pellet
而取200的白色羽毛狀(一條線)的pellet
接著都進入後續步驟
在最後用nanodrop定量時
gel-like的濃度在60ug/ul左右，260/280在1.8-2之間，但是260/230則只有1以下
羽毛狀的則濃度在100ug/ul左右，260/280在 1.5-1.6之間，260/230在2左右或是1.5-1.6之間
搜尋了網路上的討論，造成此差異的原因好像是isopropanol的量不同造成樣子pellet不同。
想請問大家..
1.正確的pellet是什麼形狀才對呢 ?
2.一般來說260/280太低是蛋白汙染，但是我很確定我沒有抽到最下粉紅色層的(很注意盯著看Q口Q)為什麼還是會污染呢?
3.260/230低是鹽類汙染，會用75%EtOH wash來改善，想請問大家wash pellet的方式是?會vortex嗎?
4.說明書上的cholorform建議是和TRIZOL 5:1 請問可以增加嗎?會增加水層的量嗎?
5.如果想將已經回溶在DEPC水裡的RNA在沉澱有建議的方法嗎?
問題很多 麻煩大家了 ! 謝謝 ~~
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 36.238.243.141
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1429276572.A.B41.html
※ 編輯: ducky313 (36.238.243.141), 04/17/2015 21:17:59
1F：推 huuban: 5>>加3倍體積的100%EtOH和10分之一體積的3M NaOAc 04/17 22:29
2F：→ huuban: -80半小時或-20 o/n，然後4度離心半小時再用75%EtOH Wash 04/17 22:29
3F：→ huuban: 4>>是5分之1，還是5:1? 04/17 22:43
4F：→ ducky313: 好像打反了是 1ml的TRIZOL加入0.2ml的choloform 謝謝 ~~ 04/17 23:02
5F：→ mcy0326: 我抽出來算是你說的一條線狀，我們用trizol:Chloroform=5 04/18 02:20
6F：→ mcy0326: 00:100，isopropanol 250ul，抽出來濃度有500～600ug/ul 04/18 02:20
7F：→ mcy0326: (3T3L1 cell)，260/280約1.98～2間 04/18 02:20
8F：→ huuban: ug/ul...我們這邊抽植物有1000 ng/ul就很高興了 (淚奔) 04/18 14:57
9F：推 Ianthegood: pellet狀態不同大概只是量的不同... 04/19 08:50