作者ducky313 (Lara)
看板Biotech
标题[求救] TRIZOL 抽 RNA的pellet形状
时间Fri Apr 17 21:16:10 2015
想请教大家几个关於用TRIZOL抽RNA的问题..
步骤大致上都是照着说明书上的进行
收集sample时 TRIZOL加 750 ul
chloroform 加 200 ul後 摇晃混浊静置 3-5 分钟後离心
接着抽取水层上清液 水层大概是有 400 ul
我只取了 100 ul或200 ul 加入400ul的isopropanol，摇晃混浊静置10mins後离心
第一个问题是
在离心後会出现RNA pellet 说明书上写的是"gel-like"pellet
而我出现了两种
只取100ul的是gel-like半透明的pellet
而取200的白色羽毛状(一条线)的pellet
接着都进入後续步骤
在最後用nanodrop定量时
gel-like的浓度在60ug/ul左右，260/280在1.8-2之间，但是260/230则只有1以下
羽毛状的则浓度在100ug/ul左右，260/280在 1.5-1.6之间，260/230在2左右或是1.5-1.6之间
搜寻了网路上的讨论，造成此差异的原因好像是isopropanol的量不同造成样子pellet不同。
想请问大家..
1.正确的pellet是什麽形状才对呢 ?
2.一般来说260/280太低是蛋白污染，但是我很确定我没有抽到最下粉红色层的(很注意盯着看Q口Q)为什麽还是会污染呢?
3.260/230低是盐类污染，会用75%EtOH wash来改善，想请问大家wash pellet的方式是?会vortex吗?
4.说明书上的cholorform建议是和TRIZOL 5:1 请问可以增加吗?会增加水层的量吗?
5.如果想将已经回溶在DEPC水里的RNA在沉淀有建议的方法吗?
问题很多 麻烦大家了 ! 谢谢 ~~
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※ 编辑: ducky313 (36.238.243.141), 04/17/2015 21:17:59
1F：推 huuban: 5>>加3倍体积的100%EtOH和10分之一体积的3M NaOAc 04/17 22:29
2F：→ huuban: -80半小时或-20 o/n，然後4度离心半小时再用75%EtOH Wash 04/17 22:29
3F：→ huuban: 4>>是5分之1，还是5:1? 04/17 22:43
4F：→ ducky313: 好像打反了是 1ml的TRIZOL加入0.2ml的choloform 谢谢 ~~ 04/17 23:02
5F：→ mcy0326: 我抽出来算是你说的一条线状，我们用trizol:Chloroform=5 04/18 02:20
6F：→ mcy0326: 00:100，isopropanol 250ul，抽出来浓度有500～600ug/ul 04/18 02:20
7F：→ mcy0326: (3T3L1 cell)，260/280约1.98～2间 04/18 02:20
8F：→ huuban: ug/ul...我们这边抽植物有1000 ng/ul就很高兴了 (泪奔) 04/18 14:57
9F：推 Ianthegood: pellet状态不同大概只是量的不同... 04/19 08:50