作者bill00202000 (handsome)
看板Biotech
標題[求救] lysis buffer是否要含imidazole
時間Sat Mar 21 21:01:47 2015
Lysis buffer: 50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM imidazole和PMSF
Wash buffer: 50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM imidazole
Binding buffer: 50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM imidazole
菌體:E. coli
首先菌養完離心後用20ml Lysis buffer回溶，在超音破菌後，離心取上清液，接著與
Ni-NTA樹脂2ml混合，在冰上搖晃2hr，倒入滴管收集流出液，之後再用wash清洗，
elution洗出目標蛋白，western後結果，蛋白都在流出液和wash的部分，所以有以下問題
想請教各位
問題:
1. Lysis buffer中imidazole功用是?那會影響蛋白與樹脂的結合嗎?
2.如何提高蛋白和樹脂的結合能力，才不會蛋白都在流出液和wash的部分
麻煩各位給小弟解答，謝謝
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1F：推 gps0110: 少量的imidazole是要減少non-specific binding 03/21 23:17
2F：推 gps0110: 你target protein的表現量高嗎？如果只有一點點 可能都被 03/21 23:19
3F：→ gps0110: 你lysis buffer中的imidazole compete掉了 03/21 23:19
4F：推 yuyu219: 你有先把bead的酒精去掉嗎？buffer的pH很重要，Ni-NTA應 03/21 23:57
5F：→ yuyu219: 該是Qiagen的，protocol應該有寫得很詳細。如果你的東西 03/21 23:57
6F：推 kg9101266: 我們用Talon Bead 一樣是抓His Tag 03/25 00:42
7F：→ kg9101266: 讓你參考一下 Lysis bf. 不含imidazole 03/25 00:43
8F：→ kg9101266: binding bf.= Lysis bf. resin使用前會先以binding bf 03/25 00:44
9F：→ kg9101266: balance數次(如果lysis bf.含detergent balance時我會 03/25 00:45
10F：→ kg9101266: 先把detergent拿掉(應該是不影響 只是怪習慣而已) 03/25 00:46
11F：→ kg9101266: wash bf.只含5mM imidazole 有時視蛋白種類還會再降 03/25 00:47
12F：→ kg9101266: Elution才使用高濃度(e.g. 100~500mM)imidazole洗脫 03/25 00:49
13F：→ bill00202000: 謝謝各位答覆，小弟我會在try看看 03/28 15:30