作者bill00202000 (handsome)
看板Biotech
标题[求救] lysis buffer是否要含imidazole
时间Sat Mar 21 21:01:47 2015
Lysis buffer: 50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM imidazole和PMSF
Wash buffer: 50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM imidazole
Binding buffer: 50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM imidazole
菌体:E. coli
首先菌养完离心後用20ml Lysis buffer回溶，在超音破菌後，离心取上清液，接着与
Ni-NTA树脂2ml混合，在冰上摇晃2hr，倒入滴管收集流出液，之後再用wash清洗，
elution洗出目标蛋白，western後结果，蛋白都在流出液和wash的部分，所以有以下问题
想请教各位
问题:
1. Lysis buffer中imidazole功用是?那会影响蛋白与树脂的结合吗?
2.如何提高蛋白和树脂的结合能力，才不会蛋白都在流出液和wash的部分
麻烦各位给小弟解答，谢谢
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1F：推 gps0110: 少量的imidazole是要减少non-specific binding 03/21 23:17
2F：推 gps0110: 你target protein的表现量高吗？如果只有一点点 可能都被 03/21 23:19
3F：→ gps0110: 你lysis buffer中的imidazole compete掉了 03/21 23:19
4F：推 yuyu219: 你有先把bead的酒精去掉吗？buffer的pH很重要，Ni-NTA应 03/21 23:57
5F：→ yuyu219: 该是Qiagen的，protocol应该有写得很详细。如果你的东西 03/21 23:57
6F：推 kg9101266: 我们用Talon Bead 一样是抓His Tag 03/25 00:42
7F：→ kg9101266: 让你参考一下 Lysis bf. 不含imidazole 03/25 00:43
8F：→ kg9101266: binding bf.= Lysis bf. resin使用前会先以binding bf 03/25 00:44
9F：→ kg9101266: balance数次(如果lysis bf.含detergent balance时我会 03/25 00:45
10F：→ kg9101266: 先把detergent拿掉(应该是不影响 只是怪习惯而已) 03/25 00:46
11F：→ kg9101266: wash bf.只含5mM imidazole 有时视蛋白种类还会再降 03/25 00:47
12F：→ kg9101266: Elution才使用高浓度(e.g. 100~500mM)imidazole洗脱 03/25 00:49
13F：→ bill00202000: 谢谢各位答覆，小弟我会在try看看 03/28 15:30