作者snow122 (雪)
看板Biotech
標題Western band定量出的ratio不穩定（再現性差）
時間Mon Feb 2 21:59:37 2015
大家好，有一事想請教
實驗室最近在建立Western，也快一年了
在其他常做Western實驗室人的鑒定下，也覺得我跑的結果很漂亮
但我發現一個問題，同一個樣本（已變性）
loading至不同片膠跑出來的band，經internal contol校正計算出ratio
常常數值是不穩定的
即使是同時、進行相同操作的兩片膠仍是如此
詳細來說
由於我要比較的樣本量多
所以必須分散在不同片膠做
但我每片膠會load一個固定的樣本，我稱它作A
第一片膠(gel 1) load A B C
第二片膠(gel 2) load A D E
由於我的internal control和要看的蛋白質
位在不同張PVDF膜（原先是一張transfer完上下裁開）
冷光照相是分次照（不是同時收訊號）
gel 1和gel 2也是分開來拍照
所以很可能會發生gel 1的A計算出的ratio是0.8
但gel 2的A則是0.6，
為了同時比較所有樣本，我會把每片的A校正成1.0
其他樣本依照和A的比例再作換算
例如gel 1 A(0.8) B(0.4) --> A(1.0) B(0.5)
gel 2 A(0.6) D(0.2) --> A(1.0) D(0.33)
如此就能把A當作媒介來比較位於不同膠上的樣本，理論上可行
但是我現在的問題，簡單來看就是把上面的D換成同樣是B
也就是明明都load同一個樣本，經校正後值卻不一樣
有的甚至差了兩倍
我問過很多實驗室
發現並沒有人真的去比較不同批次作結果是否相同
請問大家做的Western定量band再現性高嗎？
還是Western定量本來就是不準確的？
困擾已久，如有高人指正，不勝感激
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc), 來自: 140.112.154.121
※ 文章網址: https://webptt.com/m.aspx?n=bbs/Biotech/M.1422885580.A.C92.html
1F：→ roy047: loading前盡量vortex, pipetting均勻 02/02 22:20
有我十分謹慎
2F：推 aaaazzzz: 請問樓上,加入SDS加熱100度C10分鐘,spin down,不就把 02/02 22:25
3F：→ aaaazzzz: sample全load進去,此時vortex或pipet會有差異嗎？ 02/02 22:26
4F：推 aaaazzzz: 我也遇到跟作者同樣問題(我做實驗約半年),通常倍率差不 02/02 22:28
5F：→ aaaazzzz: 多的，跑出來甚至還不一致,除非是本來倍率就差很多,再現 02/02 22:29
6F：→ aaaazzzz: 性才會比較好一些,所以我也發現有些實驗室會用技術的三 02/02 22:30
7F：→ aaaazzzz: 重複來取代biologic重複 02/02 22:30
8F：推 aaaazzzz: 我覺得western blot變異性真的很大,尤其對剛做實驗的人, 02/02 22:33
9F：→ aaaazzzz: 等Simple Western比較平價跟普及之後,就會像QPCR逐漸取 02/02 22:34
10F：→ aaaazzzz: 代電泳加上Image J定量的方式 02/02 22:34
我不停爬國外網文似乎也有外國鄉民說WB僅供半定量，
要更準確的話用qPCR或ELISA，
但WB做蛋白質定量的paper也很多
（我的target protein也是參考別人做過才決定採用WB）
所以想知道是我技術不好還是沒人正視這個問題？
11F：→ blence: 每片的A算出0.6或0.8，是跟internal ctrl比,WB的data來自 02/02 22:35
12F：→ blence: Ab訊號的放大,因此不同片要得到相同ratio,很難排除Ab影響 02/02 22:36
13F：→ blence: 還有internal ctrl也是問題,有誰不是照出不飽和的band 02/02 22:40
ratio都是跟internal比，我用軟體確認band沒有飽和
（先前預實驗知道band過飽和會影響定量）
internal control和target protein是分開來拍的（見上文）
所以我刻意讓internal拍照時間縮短、拍照次數增加
就可以避免band飽和，抓到最理想的照片
14F：推 ararthur: 只要是趨勢一樣 那數值浮動於.5-.33 說老實話 真的已經 02/02 22:42
15F：→ ararthur: 很完美了 如果真的要排除這個問題 考慮鑄15well的膠吧 02/02 22:43
16F：→ ararthur: 另外那麼多sample 除非是動物實驗或screen檢體否則真的 02/02 22:44
17F：→ ararthur: 建議看看能不能試著挑掉一些不重要的sample 02/02 22:45
我數值有差到兩倍的，感覺不是很穩定
做過六次計算出的CV值變異到30%
我的實驗動物個體差異較大，所以樣本多是必要的，
但15 well也塞不下...
18F：→ blence: 你有考慮改用ELISA做嗎？ 樣本多的話,這樣更快更好定量 02/02 23:07
我現在在考慮了，當初沒考慮用是因為
參考的paper都用WB（看同樣的target protein）
19F：→ ararthur: 我是認為動物sample品質很浮動 趨勢可以一樣就已經很棒 02/02 23:08
20F：→ ararthur: 了 significance有出來 就停手吧 02/02 23:09
21F：→ ararthur: ELISA如果沒有commercial kit 想跨越技術門檻有點辛苦 02/02 23:10
你指的趨勢是說我實驗的"處理"間的趨勢嗎？
不過我同一個樣本都不大穩定了，
樣本會盡量分散loading（也就是同一片上會同時比較不同處理）
每次做趨勢也不大一致（應該是定量不穩定的緣故）
ELISA我有做過IgA的，只是不確定買一抗時
產品說明書是針對WB，是否可以通用？
22F：→ ararthur: 包含Ab1 Ab2 standard...最後curve還要能畫得出來 想到 02/02 23:11
23F：→ ararthur: 就昏了 02/02 23:11
24F：→ blence: 我們做drug screen看磷酸化蛋白,沒kit也都自己coating阿 02/02 23:14
我想到我恐怕不能用ELISA
因為我沒有我要看的target protein的標準品orz...
我的蛋白質是來自很少見的物種（台灣土雞），沒有商品T T
不管怎樣，很感謝樓上各位大大的建議
我煩惱很久了，還怕我問題太冷門要等好幾個月才有人回
我會再研究看看國外資訊，有沒有遇到相同問題
25F：推 gps0110: 如果你用相對量做elisa也不一定要絕對定量？ 02/02 23:26
咦好像也對！我會try try看
雖然還是很想解決WB的疑惑
26F：推 gps0110: 另外借問一下有沒有人用96 well的sample lysate去做elisa 02/02 23:28
27F：→ gps0110: ? 試著做過但是s/n值好低 不知道是因為不是commercial ki 02/02 23:28
28F：→ gps0110: t還是純粹sample太少 02/02 23:28
29F：推 ararthur: 我承認我曾經ELISA東西都備齊以後 看到前人慘痛經歷放棄 02/02 23:31
30F：→ ararthur: coating(掩面) 02/02 23:31
我先前測IgA是自己coating，R2一直拉不好（弄一盤就兩天了）
troubleshooting好幾個月最終才發現
原來是我用的96孔盤牌子有問題，換高檔的BD牌就0.99以上
便宜沒好貨，真的很無奈orz
連Western也是鬼打牆，感覺我做哪個實驗都被詛咒了XD
※ 編輯: snow122 (140.112.154.121), 02/02/2015 23:55:06
31F：推 allisa: 有時候實驗就是這樣 別灰心了~ 03/04 22:49