作者snow122 (雪)
看板Biotech
标题Western band定量出的ratio不稳定（再现性差）
时间Mon Feb 2 21:59:37 2015
大家好，有一事想请教
实验室最近在建立Western，也快一年了
在其他常做Western实验室人的鉴定下，也觉得我跑的结果很漂亮
但我发现一个问题，同一个样本（已变性）
loading至不同片胶跑出来的band，经internal contol校正计算出ratio
常常数值是不稳定的
即使是同时、进行相同操作的两片胶仍是如此
详细来说
由於我要比较的样本量多
所以必须分散在不同片胶做
但我每片胶会load一个固定的样本，我称它作A
第一片胶(gel 1) load A B C
第二片胶(gel 2) load A D E
由於我的internal control和要看的蛋白质
位在不同张PVDF膜（原先是一张transfer完上下裁开）
冷光照相是分次照（不是同时收讯号）
gel 1和gel 2也是分开来拍照
所以很可能会发生gel 1的A计算出的ratio是0.8
但gel 2的A则是0.6，
为了同时比较所有样本，我会把每片的A校正成1.0
其他样本依照和A的比例再作换算
例如gel 1 A(0.8) B(0.4) --> A(1.0) B(0.5)
gel 2 A(0.6) D(0.2) --> A(1.0) D(0.33)
如此就能把A当作媒介来比较位於不同胶上的样本，理论上可行
但是我现在的问题，简单来看就是把上面的D换成同样是B
也就是明明都load同一个样本，经校正後值却不一样
有的甚至差了两倍
我问过很多实验室
发现并没有人真的去比较不同批次作结果是否相同
请问大家做的Western定量band再现性高吗？
还是Western定量本来就是不准确的？
困扰已久，如有高人指正，不胜感激
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1F：→ roy047: loading前尽量vortex, pipetting均匀 02/02 22:20
有我十分谨慎
2F：推 aaaazzzz: 请问楼上,加入SDS加热100度C10分钟,spin down,不就把 02/02 22:25
3F：→ aaaazzzz: sample全load进去,此时vortex或pipet会有差异吗？ 02/02 22:26
4F：推 aaaazzzz: 我也遇到跟作者同样问题(我做实验约半年),通常倍率差不 02/02 22:28
5F：→ aaaazzzz: 多的，跑出来甚至还不一致,除非是本来倍率就差很多,再现 02/02 22:29
6F：→ aaaazzzz: 性才会比较好一些,所以我也发现有些实验室会用技术的三 02/02 22:30
7F：→ aaaazzzz: 重复来取代biologic重复 02/02 22:30
8F：推 aaaazzzz: 我觉得western blot变异性真的很大,尤其对刚做实验的人, 02/02 22:33
9F：→ aaaazzzz: 等Simple Western比较平价跟普及之後,就会像QPCR逐渐取 02/02 22:34
10F：→ aaaazzzz: 代电泳加上Image J定量的方式 02/02 22:34
我不停爬国外网文似乎也有外国乡民说WB仅供半定量，
要更准确的话用qPCR或ELISA，
但WB做蛋白质定量的paper也很多
（我的target protein也是参考别人做过才决定采用WB）
所以想知道是我技术不好还是没人正视这个问题？
11F：→ blence: 每片的A算出0.6或0.8，是跟internal ctrl比,WB的data来自 02/02 22:35
12F：→ blence: Ab讯号的放大,因此不同片要得到相同ratio,很难排除Ab影响 02/02 22:36
13F：→ blence: 还有internal ctrl也是问题,有谁不是照出不饱和的band 02/02 22:40
ratio都是跟internal比，我用软体确认band没有饱和
（先前预实验知道band过饱和会影响定量）
internal control和target protein是分开来拍的（见上文）
所以我刻意让internal拍照时间缩短、拍照次数增加
就可以避免band饱和，抓到最理想的照片
14F：推 ararthur: 只要是趋势一样 那数值浮动於.5-.33 说老实话 真的已经 02/02 22:42
15F：→ ararthur: 很完美了 如果真的要排除这个问题 考虑铸15well的胶吧 02/02 22:43
16F：→ ararthur: 另外那麽多sample 除非是动物实验或screen检体否则真的 02/02 22:44
17F：→ ararthur: 建议看看能不能试着挑掉一些不重要的sample 02/02 22:45
我数值有差到两倍的，感觉不是很稳定
做过六次计算出的CV值变异到30%
我的实验动物个体差异较大，所以样本多是必要的，
但15 well也塞不下...
18F：→ blence: 你有考虑改用ELISA做吗？ 样本多的话,这样更快更好定量 02/02 23:07
我现在在考虑了，当初没考虑用是因为
参考的paper都用WB（看同样的target protein）
19F：→ ararthur: 我是认为动物sample品质很浮动 趋势可以一样就已经很棒 02/02 23:08
20F：→ ararthur: 了 significance有出来 就停手吧 02/02 23:09
21F：→ ararthur: ELISA如果没有commercial kit 想跨越技术门槛有点辛苦 02/02 23:10
你指的趋势是说我实验的"处理"间的趋势吗？
不过我同一个样本都不大稳定了，
样本会尽量分散loading（也就是同一片上会同时比较不同处理）
每次做趋势也不大一致（应该是定量不稳定的缘故）
ELISA我有做过IgA的，只是不确定买一抗时
产品说明书是针对WB，是否可以通用？
22F：→ ararthur: 包含Ab1 Ab2 standard...最後curve还要能画得出来 想到 02/02 23:11
23F：→ ararthur: 就昏了 02/02 23:11
24F：→ blence: 我们做drug screen看磷酸化蛋白,没kit也都自己coating阿 02/02 23:14
我想到我恐怕不能用ELISA
因为我没有我要看的target protein的标准品orz...
我的蛋白质是来自很少见的物种（台湾土鸡），没有商品T T
不管怎样，很感谢楼上各位大大的建议
我烦恼很久了，还怕我问题太冷门要等好几个月才有人回
我会再研究看看国外资讯，有没有遇到相同问题
25F：推 gps0110: 如果你用相对量做elisa也不一定要绝对定量？ 02/02 23:26
咦好像也对！我会try try看
虽然还是很想解决WB的疑惑
26F：推 gps0110: 另外借问一下有没有人用96 well的sample lysate去做elisa 02/02 23:28
27F：→ gps0110: ? 试着做过但是s/n值好低 不知道是因为不是commercial ki 02/02 23:28
28F：→ gps0110: t还是纯粹sample太少 02/02 23:28
29F：推 ararthur: 我承认我曾经ELISA东西都备齐以後 看到前人惨痛经历放弃 02/02 23:31
30F：→ ararthur: coating(掩面) 02/02 23:31
我先前测IgA是自己coating，R2一直拉不好（弄一盘就两天了）
troubleshooting好几个月最终才发现
原来是我用的96孔盘牌子有问题，换高档的BD牌就0.99以上
便宜没好货，真的很无奈orz
连Western也是鬼打墙，感觉我做哪个实验都被诅咒了XD
※ 编辑: snow122 (140.112.154.121), 02/02/2015 23:55:06
31F：推 allisa: 有时候实验就是这样 别灰心了~ 03/04 22:49