作者martinyang13 (楊熊)
看板Biotech
標題[求救] western blot很奇怪的髒法
時間Tue Jan 27 22:53:14 2015
各位先進好
我們研究室最近才剛成立分生的部分 所以很多東西都還在嘗試
最近在抓L牌的半乾式轉印 i○lot2 以及後續接抗體時遇到了很多問題
像是常見的大分子轉不夠 小分子全跳海
或是marker都轉過去 sample還留了一半多在膠上 (用coomassie blue染過)
甚至GAPDH的轉漬靠邊緣的band會呈現三角形這種不均勻的狀態
不知是否有先進已經掌握這台的特性能夠指點一二
以下是主要問題
最近在冷光呈色時發現會有如下圖的直向污漬
http://i.imgur.com/CAlF1Nh.jpg
http://i.imgur.com/cI8MMnR.jpg
由於跑膠本身也是使用L牌的gradient gel 及其電泳槽
轉漬也是用他的stack跟program
之後
剪膜
T牌的TBST blocking buffer 1hr
TBST wash 15min*3
一抗 4度 overnight
TBST wash 15min*3
二抗 1hr
TBST wash 15min*3
wash大力搖 接抗體輕輕搖
其他蛋白都沒有相似現象 唯有collagen I 會出現這樣的直向污漬
不解的地方在於為什麼會是直向的? 如果是blocking出錯應該是整片髒
抗體有問題的話也應該是整片亂接
而這邊感覺又像是有點規律 不知是否有前輩遇過相似的情況?
*使用MG63及hpulp兩種人類細胞
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1F：推 lail: 直接找廠商作trouble shooting? 01/27 23:13
2F：推 abcam: T牌 如此大……不就是 要他的 service嗎？ 01/27 23:24
T牌這部分只買了blocking buffer 其他都是L牌的
可是我們這邊的L牌業務很...(略
問他也只會說他其他客人都沒問題
目前正在想辦法減低跟他的往來這樣
T牌業務很盡責每天都來 不過好像問題不在他身上
3F：→ blence: 這支collagen I抗體應該是rabbit的,而且可能是放4度C的？ 01/27 23:56
4F：→ blence: 這些廠商併來併去,我都猜不出文章寫的是什麼廠牌.. 01/27 23:58
5F：→ blence: 修正,剛看一下mouse的也會,而且都放4度C的 01/28 00:02
正是如此 所以樓上也有過類似經驗?
※ 編輯: martinyang13 (114.34.108.149), 01/28/2015 00:49:25
6F：→ williamyang: 是有純化過的抗體嗎?若是anti serum這很常出現 01/28 07:28
是純化的
7F：推 supray: 溶解度不佳的蛋白有時也會這樣 可以稀釋再跑看看 01/28 08:33
但是我們用coomassie blue染轉漬後的膠上並沒有出現這樣的拖曳痕而是清楚的band
也有直接染過未轉漬的膠 同樣也是條條分明
圖中的拖曳痕甚至比band還亮 不太可能coomassie blue染不到吧?
※ 編輯: martinyang13 (140.112.135.180), 01/28/2015 10:07:24
8F：→ blence: 同意,是純化的,純化的才能放4度,anti-serum的髒不像這樣 01/28 10:15
9F：推 silverberry: 請問是 PVDF or NC? 有用 Ponceau S 染轉好的膜嗎? 01/28 15:16
stack裡面的 應該是PVDF膜吧
有 膜上也是band很清楚 沒有這種直條的
未轉漬的膠
http://i.imgur.com/2M9Vg2I.jpg
用P0轉的膜
http://i.imgur.com/ld9Kr4y.jpg
※ 編輯: martinyang13 (140.112.135.180), 01/28/2015 15:46:00