作者martinyang13 (杨熊)
看板Biotech
标题[求救] western blot很奇怪的脏法
时间Tue Jan 27 22:53:14 2015
各位先进好
我们研究室最近才刚成立分生的部分 所以很多东西都还在尝试
最近在抓L牌的半乾式转印 i○lot2 以及後续接抗体时遇到了很多问题
像是常见的大分子转不够 小分子全跳海
或是marker都转过去 sample还留了一半多在胶上 (用coomassie blue染过)
甚至GAPDH的转渍靠边缘的band会呈现三角形这种不均匀的状态
不知是否有先进已经掌握这台的特性能够指点一二
以下是主要问题
最近在冷光呈色时发现会有如下图的直向污渍
http://i.imgur.com/CAlF1Nh.jpg
http://i.imgur.com/cI8MMnR.jpg
由於跑胶本身也是使用L牌的gradient gel 及其电泳槽
转渍也是用他的stack跟program
之後
剪膜
T牌的TBST blocking buffer 1hr
TBST wash 15min*3
一抗 4度 overnight
TBST wash 15min*3
二抗 1hr
TBST wash 15min*3
wash大力摇 接抗体轻轻摇
其他蛋白都没有相似现象 唯有collagen I 会出现这样的直向污渍
不解的地方在於为什麽会是直向的? 如果是blocking出错应该是整片脏
抗体有问题的话也应该是整片乱接
而这边感觉又像是有点规律 不知是否有前辈遇过相似的情况?
*使用MG63及hpulp两种人类细胞
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1F：推 lail: 直接找厂商作trouble shooting? 01/27 23:13
2F：推 abcam: T牌 如此大……不就是 要他的 service吗？ 01/27 23:24
T牌这部分只买了blocking buffer 其他都是L牌的
可是我们这边的L牌业务很...(略
问他也只会说他其他客人都没问题
目前正在想办法减低跟他的往来这样
T牌业务很尽责每天都来 不过好像问题不在他身上
3F：→ blence: 这支collagen I抗体应该是rabbit的,而且可能是放4度C的？ 01/27 23:56
4F：→ blence: 这些厂商并来并去,我都猜不出文章写的是什麽厂牌.. 01/27 23:58
5F：→ blence: 修正,刚看一下mouse的也会,而且都放4度C的 01/28 00:02
正是如此 所以楼上也有过类似经验?
※ 编辑: martinyang13 (114.34.108.149), 01/28/2015 00:49:25
6F：→ williamyang: 是有纯化过的抗体吗?若是anti serum这很常出现 01/28 07:28
是纯化的
7F：推 supray: 溶解度不佳的蛋白有时也会这样 可以稀释再跑看看 01/28 08:33
但是我们用coomassie blue染转渍後的胶上并没有出现这样的拖曳痕而是清楚的band
也有直接染过未转渍的胶 同样也是条条分明
图中的拖曳痕甚至比band还亮 不太可能coomassie blue染不到吧?
※ 编辑: martinyang13 (140.112.135.180), 01/28/2015 10:07:24
8F：→ blence: 同意,是纯化的,纯化的才能放4度,anti-serum的脏不像这样 01/28 10:15
9F：推 silverberry: 请问是 PVDF or NC? 有用 Ponceau S 染转好的膜吗? 01/28 15:16
stack里面的 应该是PVDF膜吧
有 膜上也是band很清楚 没有这种直条的
未转渍的胶
http://i.imgur.com/2M9Vg2I.jpg
用P0转的膜
http://i.imgur.com/ld9Kr4y.jpg
※ 编辑: martinyang13 (140.112.135.180), 01/28/2015 15:46:00