作者lyu0001 (鄉民1號)
看板Biotech
標題[求救] Insoluble蛋白純化urea回溶不佳
時間Fri Jan 23 19:57:32 2015
純化一個不溶性蛋白，破菌後溶於lysis buffer，離心後，
再把pellet回溶於含6M urea的lysis buffer，
結果發現回溶於urea的蛋白只有20～30％。Orz
不確定是不是導致蛋白質純化量很少的主要原因。
請問怎麼增加不溶性蛋白的溶解度？
有建議的方法嗎？
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1F：推 jabari: 8m 16m催下去 01/23 21:22
2F：推 Ianthegood: 7m urea +2m thiourea 01/24 08:53
一般條件是用8M urea，如果有雙硫鍵，要加還原劑打斷-s-s-
可能先試試看8M urea + DTT condition
※ 編輯: lyu0001 (123.192.204.190), 01/24/2015 11:28:38
3F：推 Ianthegood: 7m urea+2m thiourea是跑2DE最常用的cond. 01/24 15:04
4F：→ Ianthegood: 有thio基可以溶一些urea無法處理的官能基 01/24 15:05
發現問題應該出在elution pH要在5.6 or 4.5 pH7.4可能不適用...
Urea 6M改成8M 應該可以增加溶解度
更新：溶解度是改善了，但是protein binding還是很弱 Orz
flow through很多沒有binding上去
※ 編輯: lyu0001 (123.192.204.190), 01/27/2015 18:59:01
5F：推 jabari: 我覺得你表現大量再切膠回溶可能都還比較多@_@ 01/27 19:19
6F：→ Ianthegood: 7M u+ 2M thu, freeze&thaw 1x,sonication in wet ice 01/28 00:18
7F：推 kg9101266: protein induction的溫度是?會不會變成inclusion body? 03/25 00:34