作者lyu0001 (乡民1号)
看板Biotech
标题[求救] Insoluble蛋白纯化urea回溶不佳
时间Fri Jan 23 19:57:32 2015
纯化一个不溶性蛋白，破菌後溶於lysis buffer，离心後，
再把pellet回溶於含6M urea的lysis buffer，
结果发现回溶於urea的蛋白只有20～30％。Orz
不确定是不是导致蛋白质纯化量很少的主要原因。
请问怎麽增加不溶性蛋白的溶解度？
有建议的方法吗？
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1F：推 jabari: 8m 16m催下去 01/23 21:22
2F：推 Ianthegood: 7m urea +2m thiourea 01/24 08:53
一般条件是用8M urea，如果有双硫键，要加还原剂打断-s-s-
可能先试试看8M urea + DTT condition
※ 编辑: lyu0001 (123.192.204.190), 01/24/2015 11:28:38
3F：推 Ianthegood: 7m urea+2m thiourea是跑2DE最常用的cond. 01/24 15:04
4F：→ Ianthegood: 有thio基可以溶一些urea无法处理的官能基 01/24 15:05
发现问题应该出在elution pH要在5.6 or 4.5 pH7.4可能不适用...
Urea 6M改成8M 应该可以增加溶解度
更新：溶解度是改善了，但是protein binding还是很弱 Orz
flow through很多没有binding上去
※ 编辑: lyu0001 (123.192.204.190), 01/27/2015 18:59:01
5F：推 jabari: 我觉得你表现大量再切胶回溶可能都还比较多@_@ 01/27 19:19
6F：→ Ianthegood: 7M u+ 2M thu, freeze&thaw 1x,sonication in wet ice 01/28 00:18
7F：推 kg9101266: protein induction的温度是?会不会变成inclusion body? 03/25 00:34