你已經troubleshoot蠻多的了, 所以其實答案蠻明確的~ ※ 引述《churchfire (別小看我...)》之銘言： : 標題: [求救] Real-time PCR NTC訊號時有時無 : 時間: Thu Jan 9 16:20:05 2014 : 小弟使用Roter gene 6000的real-time PCR machine. : Master-Mix為Bioline NO-ROX SYBR-Green : Total Reaction volum為20ul : 檢體為plant Genomic DNA : 問題是:我時常NTC(no-template control, 我用滅菌的無菌水)會有singal : Ct值直逼20-35左右~~~ 20-35 range還蠻大的. 而且要看你cutoff怎麼切 如果是35,甚至33, 都有可能是背景 (cutoff調一下就有可能了) 如果是20, 那一定不是背景 : 我的primer量也下很少，各約100nM : 至於是否有primer dimer，我是使用網路上的軟體設計的，我想應該沒有dimer的情形 : 我也將product去跑電泳切膠，amplicaon size 大約100bp， : 這個確定就不是primer dimer了!! : 我也加上melting curve，產物專一性很高，和我其他有加template的相當 到這裡就很確定不是background了 : 有時會有出現，一般第一次打開的無菌水(或是廠商的水)都不會有singal : 但第二次用的時候就有了，或是到第三次出現!@@ 水,eppendorf或pipetman污染 : 也分裝處理(一次用完就把那罐水丟掉)，竟然也是如此!! 到這裡排除水了 : 請問大家有遇過這樣的狀況嗎?? : : PS:我們實驗室是電泳、Bench、machine都擺在同一大間實驗室的那種!! : 會不會是air contamination? 要air contamination的機會遠小於有genomic DNA殘留在你的實驗器具上 而且你的重現性太高了 所以是很系統性的污染 : ◆ From: 210.69.175.253 : → puec2:pipetman 污染 送去給人清吧 01/09 16:24 : → churchfire:才剛清回來!! 01/09 16:28 : → churchfire:有做同一時間用不同的水進行實驗!!有些水有，有些無! 01/09 16:28 : → puec2:那就可能是你的reagent已經污染到genomic DNA了 01/09 16:29 : → roy047:buffer dNTP 內是否有汙染? 01/09 16:30 基本上你現在變成要全面找污染源了 1. 去隔壁實驗室用他們的pipettman, 他們的bench, 開一包全新的plate, 所肴reagent全部在隔壁實驗拆封, 用他們的手套...等等. setup plate 跑PCR 若無意外應該NTC會完全沒有訊號 全程用filter tips 2. 再來用上述"只拆封用了一次"的reagent, 搬回你的bench, 但借用他們的pipettman, setup plate然後跑一次 排除你的pipettman的問題 全程用filter tips 3. 如果2是negative, 再換你原來reagent,一次換一種, 直到重現NTC有signal為止 另外如果回到你的bench就開始有問題, 考慮清bench google 一下clean up bench for genomic DNA contamination 有很多怪招, HCl, bleach, DNase....等 因為bench上的DNA 污染是最不易證明的, 但手套東摸西摸就帶到sample裡了 題外話: 個人覺得如果可行, 全lab使用公用reagent如polymerase, dNTP等 應該全面強制使用filter tip. --

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