你已经troubleshoot蛮多的了, 所以其实答案蛮明确的~ ※ 引述《churchfire (别小看我...)》之铭言： : 标题: [求救] Real-time PCR NTC讯号时有时无 : 时间: Thu Jan 9 16:20:05 2014 : 小弟使用Roter gene 6000的real-time PCR machine. : Master-Mix为Bioline NO-ROX SYBR-Green : Total Reaction volum为20ul : 检体为plant Genomic DNA : 问题是:我时常NTC(no-template control, 我用灭菌的无菌水)会有singal : Ct值直逼20-35左右~~~ 20-35 range还蛮大的. 而且要看你cutoff怎麽切 如果是35,甚至33, 都有可能是背景 (cutoff调一下就有可能了) 如果是20, 那一定不是背景 : 我的primer量也下很少，各约100nM : 至於是否有primer dimer，我是使用网路上的软体设计的，我想应该没有dimer的情形 : 我也将product去跑电泳切胶，amplicaon size 大约100bp， : 这个确定就不是primer dimer了!! : 我也加上melting curve，产物专一性很高，和我其他有加template的相当 到这里就很确定不是background了 : 有时会有出现，一般第一次打开的无菌水(或是厂商的水)都不会有singal : 但第二次用的时候就有了，或是到第三次出现!@@ 水,eppendorf或pipetman污染 : 也分装处理(一次用完就把那罐水丢掉)，竟然也是如此!! 到这里排除水了 : 请问大家有遇过这样的状况吗?? : : PS:我们实验室是电泳、Bench、machine都摆在同一大间实验室的那种!! : 会不会是air contamination? 要air contamination的机会远小於有genomic DNA残留在你的实验器具上 而且你的重现性太高了 所以是很系统性的污染 : ◆ From: 210.69.175.253 : → puec2:pipetman 污染 送去给人清吧 01/09 16:24 : → churchfire:才刚清回来!! 01/09 16:28 : → churchfire:有做同一时间用不同的水进行实验!!有些水有，有些无! 01/09 16:28 : → puec2:那就可能是你的reagent已经污染到genomic DNA了 01/09 16:29 : → roy047:buffer dNTP 内是否有污染? 01/09 16:30 基本上你现在变成要全面找污染源了 1. 去隔壁实验室用他们的pipettman, 他们的bench, 开一包全新的plate, 所肴reagent全部在隔壁实验拆封, 用他们的手套...等等. setup plate 跑PCR 若无意外应该NTC会完全没有讯号 全程用filter tips 2. 再来用上述"只拆封用了一次"的reagent, 搬回你的bench, 但借用他们的pipettman, setup plate然後跑一次 排除你的pipettman的问题 全程用filter tips 3. 如果2是negative, 再换你原来reagent,一次换一种, 直到重现NTC有signal为止 另外如果回到你的bench就开始有问题, 考虑清bench google 一下clean up bench for genomic DNA contamination 有很多怪招, HCl, bleach, DNase....等 因为bench上的DNA 污染是最不易证明的, 但手套东摸西摸就带到sample里了 题外话: 个人觉得如果可行, 全lab使用公用reagent如polymerase, dNTP等 应该全面强制使用filter tip. --

※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc) ◆ From: 137.131.186.0