作者godinal (無心)
看板Biotech
標題[求救] 請問Real-time PCR相關問題
時間Wed Dec 18 23:30:02 2013
由於最近開始學習做Real Time PCR, 發生了很多問題...想詢問前輩們有何建議
原本實驗計劃是將檢體分別測二個gene...P1及IC後相減計算deltaCt值做相對定量
第一次做時就發生internal control primer之positive control看不到訊號
所以同樣實驗再做一次...發現Ct值接近四十
和實驗室前輩討論, 及troubleshouting後, 他覺得是tag enzyme(Roche)不穩定
把enzyme由原本實驗條件0.3ul改為1ul後, internal control之Ct值就回歸28Ct
結果....就換成target gene P1出狀況
原本annealing溫度設為64度，但某天突然連positive control都沒有signal...
結果...做PCR捉條件發現64度做不出來，annealing 溫度改為57度
但在做Validation時發現57度連Negative control都出現訊號，而且Ct約30
後來帶我的前輩再重新捉條件將annealing 溫度改為60度
但前輩用60度做出來negative control Ct值大都在40以後,
但我用同樣的條件Ct值都在30左右
後來我們懷疑可能是我chemical污染，把所有的reagent都換新
狀況還是沒有改善...有時Negative control有signal，
有時positive control沒有signal
後來前輩懷疑水污染...所以決定換成One PCR...減少污染機率
但我一直覺得很怪...為什麼實驗會這麼不穩定?
捉好的條件annealing溫度會這樣變來變去
Ct值差異性也很大...時有時無的...
前輩叫我腦力激盪看哪裡有問題?
但由於第一次接觸real time PCR...完全沒有概念
所以想上來問問看有沒有前輩有經驗..可以給一點建議
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◆ From: 42.73.198.254
1F：推 KittyGod:你要不要先做一般pcr確定條件 12/18 23:42
2F：→ godinal:通常碰到問題都有前輩先用PCR check後才告知實條件 12/19 08:37
3F：→ godinal:只是覺得怪..原本捉好annealing條件竟然會變.. 12/19 08:38
4F：→ godinal:PCR會有這麼不穩定嗎?? 12/19 08:38
5F：推 CErline:用別台做做看，說不定控溫裝置不穩定 12/19 10:32
6F：→ godinal:請問控溫裝制會造成negative control有訊號嗎?? 12/19 11:53
7F：→ roy047:升降溫太慢易形成primer dimer 12/20 08:54
8F：→ godinal:所以說不論reagent如何調整，如果是機器升降溫問題就無解 12/20 10:06
9F：推 huangsw:我之前是做abi的, 你做過dissociation curve了嗎？ 12/20 15:28
10F：→ godinal:老實說..我真的不大懂dissociation curve怎麼做 12/21 22:32
11F：推 huangsw:問一下special list吧！ 我沒操作過ROCHE的XD 12/22 13:43