作者godinal (无心)
看板Biotech
标题[求救] 请问Real-time PCR相关问题
时间Wed Dec 18 23:30:02 2013
由於最近开始学习做Real Time PCR, 发生了很多问题...想询问前辈们有何建议
原本实验计划是将检体分别测二个gene...P1及IC後相减计算deltaCt值做相对定量
第一次做时就发生internal control primer之positive control看不到讯号
所以同样实验再做一次...发现Ct值接近四十
和实验室前辈讨论, 及troubleshouting後, 他觉得是tag enzyme(Roche)不稳定
把enzyme由原本实验条件0.3ul改为1ul後, internal control之Ct值就回归28Ct
结果....就换成target gene P1出状况
原本annealing温度设为64度，但某天突然连positive control都没有signal...
结果...做PCR捉条件发现64度做不出来，annealing 温度改为57度
但在做Validation时发现57度连Negative control都出现讯号，而且Ct约30
後来带我的前辈再重新捉条件将annealing 温度改为60度
但前辈用60度做出来negative control Ct值大都在40以後,
但我用同样的条件Ct值都在30左右
後来我们怀疑可能是我chemical污染，把所有的reagent都换新
状况还是没有改善...有时Negative control有signal，
有时positive control没有signal
後来前辈怀疑水污染...所以决定换成One PCR...减少污染机率
但我一直觉得很怪...为什麽实验会这麽不稳定?
捉好的条件annealing温度会这样变来变去
Ct值差异性也很大...时有时无的...
前辈叫我脑力激荡看哪里有问题?
但由於第一次接触real time PCR...完全没有概念
所以想上来问问看有没有前辈有经验..可以给一点建议
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 42.73.198.254
1F：推 KittyGod:你要不要先做一般pcr确定条件 12/18 23:42
2F：→ godinal:通常碰到问题都有前辈先用PCR check後才告知实条件 12/19 08:37
3F：→ godinal:只是觉得怪..原本捉好annealing条件竟然会变.. 12/19 08:38
4F：→ godinal:PCR会有这麽不稳定吗?? 12/19 08:38
5F：推 CErline:用别台做做看，说不定控温装置不稳定 12/19 10:32
6F：→ godinal:请问控温装制会造成negative control有讯号吗?? 12/19 11:53
7F：→ roy047:升降温太慢易形成primer dimer 12/20 08:54
8F：→ godinal:所以说不论reagent如何调整，如果是机器升降温问题就无解 12/20 10:06
9F：推 huangsw:我之前是做abi的, 你做过dissociation curve了吗？ 12/20 15:28
10F：→ godinal:老实说..我真的不大懂dissociation curve怎麽做 12/21 22:32
11F：推 huangsw:问一下special list吧！ 我没操作过ROCHE的XD 12/22 13:43