作者cool155113 (Boy)
看板Biotech
標題[求救] pro 5-alpha 的 Competent cell 製作
時間Tue Nov 19 18:14:32 2013
發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
以方便板友幫您追蹤問題
若是求救事項涉及實驗室智慧財產(例如細胞細菌植株、質體載體等）之分讓，
請務必註明貴實驗室願意設立 正式合作或 簽署材料分讓協議(MTA)，否則版工將逕行刪除
----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章----
目前我做Competent cell
菌種是pro 5-alpha
做法是Rubidium Chloride method：
前一天先將菌養在10 ml O/N
隔天1/100加入培養
當A600到達 0.5 冰浴15min左右
用0.4被體積的Tfb I 沖洗，放冰上15 min 左右
再用1/100的 Tfb II 洗 ，放冰上 15min 左右
最後分裝 50 ul，迅速放入液態氮
最後裝盒放 -80度保存
隔天測效率：
分別用濃度 100pg / ul
1 ng / ul
10 ng / ul
的DNA，加入 5ul
冰上靜置30 min，42度heat shock 1 分鐘
迅速放冰上等5分鐘
將細菌放入 1 ml 的LB，培養一小時
取 100 ul 圖盤
結果效率卻只有 5 * 10 ^5
效率頗低。。。
想請問有人做過該菌種嗎？
還是有認為哪一步錯了呢？
謝謝 Orz
--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.93.195
1F：→ cool155113:對了，5*10^5 效率 是在濃度 10 ng / ul 的DNA中算到 11/19 18:29
2F：→ cool155113:100 pg / ul ， 1 nl / ul的菌落很少，大約5～10顆 11/19 18:30
3F：→ cool155113:這是為什麼？？ 謝謝 11/19 18:30
4F：推 Ianthegood:我覺得以chemical來說這濃度ok了阿 11/19 23:32
5F：→ cool155113:OK嗎？ 老師一直說一般來說效率為1*10^7以上 11/19 23:54
6F：→ cool155113:可是老師也不知道哪個步驟該改進。。。一直無限循環 11/19 23:55
7F：→ Ianthegood:efficiency的單位是cfu/ug 換算一下 11/20 08:57
8F：→ Ianthegood:我的話前兩部冰浴會再久一點 11/20 08:58
9F：→ cool155113:efficiency的算法是，數到的菌落/DNA濃度*加入ul量 11/20 09:39
10F：→ cool155113:舉例來說：10ng/ul，有1000顆 11/20 09:40
11F：→ cool155113:就是 1000/ 10 * 5 = 20 clone / ng 11/20 09:41
12F：→ cool155113:然後換算成 clone/ ug = 20000 clone/ ug 11/20 09:41
13F：→ cool155113:最後因養在1000ul 只取 100ul 塗盤，所以在 * 10 11/20 09:42
14F：→ cool155113:所以獲得 2 * 10^5 clone / ug 的轉質效率 11/20 09:43
15F：→ cool155113:有算錯嗎？ 對了，其實有試過前兩個步驟放久一點 11/20 09:44
16F：→ cool155113:可是效果還是一樣 Orz 11/20 09:44
17F：推 icome:re-suspension多次一點效果更好 O.D.0.3左右效率就很高 11/23 18:20
18F：→ icome:0.5有點危險 過了0.5效率會陡降 11/23 18:20
19F：→ cool155113:想問一下，因為網路上的流程都是Tfb II加0.04倍的體積 11/23 18:51
20F：→ cool155113:但我們都是加0.01倍的體積，不知道這樣回不會有影響 11/23 18:52