作者cool155113 (Boy)
看板Biotech
标题[求救] pro 5-alpha 的 Competent cell 制作
时间Tue Nov 19 18:14:32 2013
发问时请注意，若是要问实验相关的问题，请将实验的步骤、所用的条件大致列出
以方便板友帮您追踪问题
若是求救事项涉及实验室智慧财产(例如细胞细菌植株、质体载体等）之分让，
请务必注明贵实验室愿意设立 正式合作或 签署材料分让协议(MTA)，否则版工将迳行删除
----请将上列注意事项以 ctrl + k 删除後开始编辑文章----
目前我做Competent cell
菌种是pro 5-alpha
做法是Rubidium Chloride method：
前一天先将菌养在10 ml O/N
隔天1/100加入培养
当A600到达 0.5 冰浴15min左右
用0.4被体积的Tfb I 冲洗，放冰上15 min 左右
再用1/100的 Tfb II 洗 ，放冰上 15min 左右
最後分装 50 ul，迅速放入液态氮
最後装盒放 -80度保存
隔天测效率：
分别用浓度 100pg / ul
1 ng / ul
10 ng / ul
的DNA，加入 5ul
冰上静置30 min，42度heat shock 1 分钟
迅速放冰上等5分钟
将细菌放入 1 ml 的LB，培养一小时
取 100 ul 图盘
结果效率却只有 5 * 10 ^5
效率颇低。。。
想请问有人做过该菌种吗？
还是有认为哪一步错了呢？
谢谢 Orz
--
※ 发信站: 批踢踢实业坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.93.195
1F：→ cool155113:对了，5*10^5 效率 是在浓度 10 ng / ul 的DNA中算到 11/19 18:29
2F：→ cool155113:100 pg / ul ， 1 nl / ul的菌落很少，大约5～10颗 11/19 18:30
3F：→ cool155113:这是为什麽？？ 谢谢 11/19 18:30
4F：推 Ianthegood:我觉得以chemical来说这浓度ok了阿 11/19 23:32
5F：→ cool155113:OK吗？ 老师一直说一般来说效率为1*10^7以上 11/19 23:54
6F：→ cool155113:可是老师也不知道哪个步骤该改进。。。一直无限循环 11/19 23:55
7F：→ Ianthegood:efficiency的单位是cfu/ug 换算一下 11/20 08:57
8F：→ Ianthegood:我的话前两部冰浴会再久一点 11/20 08:58
9F：→ cool155113:efficiency的算法是，数到的菌落/DNA浓度*加入ul量 11/20 09:39
10F：→ cool155113:举例来说：10ng/ul，有1000颗 11/20 09:40
11F：→ cool155113:就是 1000/ 10 * 5 = 20 clone / ng 11/20 09:41
12F：→ cool155113:然後换算成 clone/ ug = 20000 clone/ ug 11/20 09:41
13F：→ cool155113:最後因养在1000ul 只取 100ul 涂盘，所以在 * 10 11/20 09:42
14F：→ cool155113:所以获得 2 * 10^5 clone / ug 的转质效率 11/20 09:43
15F：→ cool155113:有算错吗？ 对了，其实有试过前两个步骤放久一点 11/20 09:44
16F：→ cool155113:可是效果还是一样 Orz 11/20 09:44
17F：推 icome:re-suspension多次一点效果更好 O.D.0.3左右效率就很高 11/23 18:20
18F：→ icome:0.5有点危险 过了0.5效率会陡降 11/23 18:20
19F：→ cool155113:想问一下，因为网路上的流程都是Tfb II加0.04倍的体积 11/23 18:51
20F：→ cool155113:但我们都是加0.01倍的体积，不知道这样回不会有影响 11/23 18:52