作者bbiioo (meimei)
看板Biotech
標題[求救] pcr產物長度有問題
時間Fri Nov 15 16:31:50 2013
實驗內容:
將細胞養在dish，加入不同藥物濃度，作用後
抽取total RNA
進行RT-PCR，得到cDNA
再進行PCR擴增我要的片段
我預設跑膠後的結果
會是 不同藥物濃度處理後的細胞所得到的片段
應該會是大小一樣 濃度會不同
但實際跑出來的結果
是片段大小會有差距 而且是比原先預設的片段大小還大
為什麼會有這樣的結果?
是引子設計有問題嗎?
還是cDNA有問題?
不知道有沒有人有經驗作過的 幫幫忙解個答
謝謝哩
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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 114.26.145.230
1F：推 Bows:會不會是你的藥物影響到你RNA的splicing? 11/15 16:35
2F：→ xxtomnyxx:首先想到的可能性同樓上，去查包含有intron的mRNA長度 11/15 16:42
3F：→ xxtomnyxx:跟你的產物比對一下？ 11/15 16:42
4F：→ bbiioo:請問你們意思是說 alternation splicing嗎? 11/15 16:48
5F：→ puec2:發了發了 但是堵10000 p幣你老闆不敢繼續做下去 11/15 16:59
6F：→ qiet:賺到惹~~~定序看看~? 11/15 17:32
7F：→ saviora:再重複幾次吧 如果是那可能就是在splicing上的影響 11/15 17:59
8F：→ saviora:不過有做positive control嗎 11/15 18:00
加藥濃度是從0往上增加這樣 所以~是跟無加藥處理的DNA比較，位置不一樣
9F：推 caesar0926:把primer丟到 primaer-blast 看會有那些產物試試 11/15 19:11
10F：→ caesar0926: primer 11/15 19:12
我會去比對看看!
11F：→ caesar0926:看不懂兩個意思 得到cDNA library? 和mager band?? 11/15 19:15
12F：推 caesar0926:或是 抽RNA時沒處理 讓genomic DNA 殘留 11/15 19:17
※ 編輯: bbiioo 來自: 111.252.239.8 (11/18 09:32)
13F：→ bbiioo:打錯了是major band 11/18 09:33
14F：→ bbiioo:genomic DNA可能有殘留 但引子設計有跨exon了.. 11/18 09:35
※ 編輯: bbiioo 來自: 111.252.239.8 (11/18 09:39)
15F：→ blence:請考慮產品長度,跨的intron長度說一下比較好討論,有些intro 11/18 11:47
16F：→ blence:才100~200bp,不是有跨就沒問題 11/18 11:50
17F：→ blence:另外是你做了幾次,換cell line? 定序了沒? 11/18 11:55
18F：→ bbiioo:恩 因為是不同cell line不同基因都有這現象 11/18 21:58
19F：→ bbiioo:我會再比對看看 11/18 21:59