作者Marrisay (可愛的Comomo)
看板Biotech
標題[求救]stable cell line
時間Thu Nov 14 00:49:07 2013
各位大大好
我最近在建立stable cell line (使用HEK293)
transfect plasmid into cells後24hr
我換fresh的medium後(第二天)
隔天繼續讓cells長多一點(第三天)
在這幾個步驟間我都有觀察發螢光cells的比例
第二天及第三天比例都有在70%
但第四天準備要加G418篩選前
發現螢光cells的比例卻降低至20%左右
不知為什麼會這樣?
還是這是正常現象?
請各位大大能幫忙解惑
謝謝大家!
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◆ From: 58.114.221.18
※ 編輯: Marrisay 來自: 58.114.221.18 (11/14 00:56)
1F：→ williamyang:是transient transfection?時間過就會開始下降 11/14 08:28
2F：推 HEK293:episome 11/14 08:42
3F：推 tsubasawolfy:就一樓說的...去蕪存菁 11/14 08:50
4F：→ xxtomnyxx:剩下會亮的 20% 不是一開始吃了特別多 plasmid，就是已 11/14 10:19
5F：→ xxtomnyxx:經嵌入 genomic DNA 變成 stable clone 了。 11/14 10:19
6F：→ xxtomnyxx:順帶一提，我連用帶有SV40 ori的plasmid轉到293T中，經 11/14 10:20
7F：→ xxtomnyxx:過6天也只剩下10%不到...... 11/14 10:21
8F：→ puec2:不錯的資訊 11/14 10:51
9F：推 yanziyeh:可以試試看用infection建立stable clone 11/15 14:17
10F：→ puec2:沒差吧 反正都要用挑的 11/15 14:53
11F：→ xxtomnyxx:我給個方向吧：Scaffold/Matrix Attachment region 11/15 15:52
12F：→ xxtomnyxx:等我回到研究所之後我打算用這個做做看，這是用episome 11/15 15:53
13F：→ xxtomnyxx:建立stable clone的方法，但是現在用這個技術的研究還不 11/15 15:53
14F：→ xxtomnyxx:普及。 11/15 15:53
15F：推 HEK293:S/MAR其實一陣子了喔...至少聽聞Stanford已經做很開心去了 11/15 16:16
16F：→ xxtomnyxx:1990 就有啦～ 但是我沒有看到很多用S/MAR做長時間over 11/15 16:19
17F：→ xxtomnyxx:expression或knock-down的paper。 11/15 16:19
18F：→ puec2:現在最紅的是TALEN 11/15 16:46
19F：→ HEK293:之前不是還有transposon，睡美人或piggyBac之類的也行 11/15 16:50
20F：→ xxtomnyxx:但是那些都會插到genomic，有可能會改變genomic的表現 11/15 16:56
21F：→ puec2:那就多挑幾個啊... transgenic plant還不是一樣... 11/15 16:58
22F：→ puec2:TALEN的優勢是你可以決定要插哪裡呦 11/15 16:58
23F：→ puec2:理論上是不會亂插 >///< 11/15 16:59
24F：→ xxtomnyxx:怕就是怕在好死不死選到有功能的區域......很多序列到底 11/15 17:51
25F：→ xxtomnyxx:有什麼功能其實也都還未知，就算序列真的沒功能，也可 11/15 17:52
26F：→ xxtomnyxx:能改變DNA長度讓某些regulation elements異常，所以我才 11/15 17:53
27F：→ xxtomnyxx:比較喜歡episome (ˊ _>ˋ) 11/15 17:53
28F：→ puec2:用TALEN你可以直接插在你要改變的基因上阿... 11/15 20:24
29F：推 aceliang:那來個AAV如何? 11/15 20:42