作者mango1986 (水球是甚麼 能吃嗎)
看板Biotech
標題[求救] 收protein濃度很低
時間Wed Nov 6 11:03:33 2013
如題 protein抽出來濃度極低阿
濃度都是1ug/ul 上下遊走 loading量真的很大 >"<
但是沒有錢買任何濃縮的kit ，所以只能想辦法改善問題
首先實驗室現在用RIPA lysis buffer with 0.1%SDS 但是之前沒有SDS
抽出來的protein量就比較多 還是是SDS影響?
還有大家都如何抽出高濃度的protein?
再來lab實驗步驟是
6cm dish 的細胞 PBS wash後吸乾
直接加100ul lysis buffer刮下來
然後放置4℃ 於旋轉盤上轉15min
之後離心取液體部分
但有些問題就是加了有些特定藥物離心的pellet會呈現黏稠狀
(但是我收之前觀察細胞沒死還滿滿的，MTT assy 也跟control組差不多)
像這樣黏稠的pellet 通常刮細胞時有就呈現鼻涕樣的黏稠狀
這樣又是為甚麼?
希望大家幫我解答 謝謝了 :)
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◆ From: 140.123.85.162
1F：推 tsubasawolfy:多做一步sonication 你會發現另一片天 11/06 11:36
所以是刮下來後sonication再去轉
2F：→ blence:60mm dish加100ul,會不會覺得收下來的體積增減的變化很大? 11/06 12:35
我也是有多加過但是濃度一樣低
3F：推 IDIDyan:有加protease和phosphotase inhibitor嗎? 11/06 15:57
4F：→ puec2:6cm加100.... 11/06 16:51
5F：→ bpjp:6cm加100有覆蓋整個底盤嗎?還有inhibitor很重要 11/06 16:56
請問你們6cm都加多少呢?
6F：→ jsi:大概是新的lysis buffer更強大了，讓DNA都跑出來，如一樓所說 11/06 23:36
7F：→ jsi:多做一步sonication就行了。 11/06 23:36
但是DNA跑出來都只限於我加了藥後的細胞，而且其他人沒DNA跑出來這困擾
8F：推 julsummer:6公分只加100太少了吧，再多加100~150吧！ 11/07 07:53
好低 :)
9F：→ julsummer:實驗室沒人帶你實驗嗎？這你的問題很基礎欸 11/07 07:55
我知道是黏稠是DNA，但是因為同時間收的都只有加了藥的sample才這樣，所以才想
問一下看看是否有其他見解， 至於加100ul 是我們lab歷屆來學長姐都這樣做也是
沒問題，以前用沒有SDS的lysis buffer濃度也不錯
10F：推 HEK293:其實我6cm都只加70ul...Orz，lysis buffer還自己泡 11/07 11:44
跟我們家一樣甚麼都自己泡，窮實驗室只能這樣，那你加70ul 濃度還可以嗎?
※ 編輯: mango1986 來自: 140.123.85.162 (11/07 14:16)
11F：→ blence:SDS會影響濃度測定,跟你用的assay有關,6cm用100ul在我用的 11/07 14:36
12F：→ blence:十幾種human lines,多是刮下來用這個量,何況你是直加plate 11/07 14:38
13F：→ blence:藥物的部分,MTT是outcome,無法連結藥物是否影響DNA extract 11/07 14:41
14F：→ blence:如果步驟只是有沒加SDS的差別,我那會猜你是用的定量方法 11/07 14:44
15F：推 dehydrogenas:我很好奇你用甚麼方法定量 11/13 12:15
16F：→ chaunen:我覺得你SDS加不只0.1%吧 11/25 07:10
17F：→ chaunen:太多SDS DNA會沉澱不好(如果ChIP有用福馬林固定就不會 XD) 11/25 07:13