作者mango1986 (水球是甚麽 能吃吗)
看板Biotech
标题[求救] 收protein浓度很低
时间Wed Nov 6 11:03:33 2013
如题 protein抽出来浓度极低阿
浓度都是1ug/ul 上下游走 loading量真的很大 >"<
但是没有钱买任何浓缩的kit ，所以只能想办法改善问题
首先实验室现在用RIPA lysis buffer with 0.1%SDS 但是之前没有SDS
抽出来的protein量就比较多 还是是SDS影响?
还有大家都如何抽出高浓度的protein?
再来lab实验步骤是
6cm dish 的细胞 PBS wash後吸乾
直接加100ul lysis buffer刮下来
然後放置4℃ 於旋转盘上转15min
之後离心取液体部分
但有些问题就是加了有些特定药物离心的pellet会呈现黏稠状
(但是我收之前观察细胞没死还满满的，MTT assy 也跟control组差不多)
像这样黏稠的pellet 通常刮细胞时有就呈现鼻涕样的黏稠状
这样又是为甚麽?
希望大家帮我解答 谢谢了 :)
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◆ From: 140.123.85.162
1F：推 tsubasawolfy:多做一步sonication 你会发现另一片天 11/06 11:36
所以是刮下来後sonication再去转
2F：→ blence:60mm dish加100ul,会不会觉得收下来的体积增减的变化很大? 11/06 12:35
我也是有多加过但是浓度一样低
3F：推 IDIDyan:有加protease和phosphotase inhibitor吗? 11/06 15:57
4F：→ puec2:6cm加100.... 11/06 16:51
5F：→ bpjp:6cm加100有覆盖整个底盘吗?还有inhibitor很重要 11/06 16:56
请问你们6cm都加多少呢?
6F：→ jsi:大概是新的lysis buffer更强大了，让DNA都跑出来，如一楼所说 11/06 23:36
7F：→ jsi:多做一步sonication就行了。 11/06 23:36
但是DNA跑出来都只限於我加了药後的细胞，而且其他人没DNA跑出来这困扰
8F：推 julsummer:6公分只加100太少了吧，再多加100~150吧！ 11/07 07:53
好低 :)
9F：→ julsummer:实验室没人带你实验吗？这你的问题很基础欸 11/07 07:55
我知道是黏稠是DNA，但是因为同时间收的都只有加了药的sample才这样，所以才想
问一下看看是否有其他见解， 至於加100ul 是我们lab历届来学长姐都这样做也是
没问题，以前用没有SDS的lysis buffer浓度也不错
10F：推 HEK293:其实我6cm都只加70ul...Orz，lysis buffer还自己泡 11/07 11:44
跟我们家一样甚麽都自己泡，穷实验室只能这样，那你加70ul 浓度还可以吗?
※ 编辑: mango1986 来自: 140.123.85.162 (11/07 14:16)
11F：→ blence:SDS会影响浓度测定,跟你用的assay有关,6cm用100ul在我用的 11/07 14:36
12F：→ blence:十几种human lines,多是刮下来用这个量,何况你是直加plate 11/07 14:38
13F：→ blence:药物的部分,MTT是outcome,无法连结药物是否影响DNA extract 11/07 14:41
14F：→ blence:如果步骤只是有没加SDS的差别,我那会猜你是用的定量方法 11/07 14:44
15F：推 dehydrogenas:我很好奇你用甚麽方法定量 11/13 12:15
16F：→ chaunen:我觉得你SDS加不只0.1%吧 11/25 07:10
17F：→ chaunen:太多SDS DNA会沉淀不好(如果ChIP有用福马林固定就不会 XD) 11/25 07:13