各位賢拜好！ 想請教一下常做雙染的高手 一些關於compensation的問題 我先簡述一下我的實驗設計 我的實驗本身是在做細胞Autophagocytosis 將一種細胞以apoptosis inducer誘導apoptosis之後 看活的細胞能否將凋亡的同種細胞進行apoptosis 用的大概方法如下 1.將活細胞以PKH67細胞膜染劑(綠螢光)進行染色 2.將欲被吞噬的活細胞或死細胞以PKH26細胞膜染劑(紅螢光)進行染色 3.各別以BSA進行染色反應中止 4.將兩種染好色的細胞混和進行吞噬 5.吞噬反應完成後wash再回溶上Flow以雙染進行測定 其中在實驗組別 在實驗中欲看細胞死亡 是否會造成活細胞autophagocytosis有所增加 因此我以活細胞吞活細胞的組別為control 另設計下列四管用以調整flow設定 1.兩種細胞均不染色 2.活細胞染色(PKH67) 欲被吞噬活細胞不染 3.活細胞不染 欲被吞噬活細胞染色(PKH 26) 4.雙染Control 先上1.調整FSC.SSC.FL1-H.FL2-H至理想設定 之後這些設定就不動了 再分別上2.3調整Compensation 最後再上雙染control看設定有無跑掉 之後就跑各實驗組別 但調整過程中卻發現 3.單染欲被吞噬活細胞染PKH 26這管 (檔案中的第二張圖) 怎麼調Compensation都沒辦法調進FL1-H到10^1以內 但調另一管單染活細胞的compensation(第三張圖) 卻可以很快的將FL2-H調到OK的程度 在不得已的狀況下 在分析時只好把十字往右拉 再來看Double positive(表示細胞有被吞噬)的比例 想請問一下 這樣的狀況要如何調整設定? 很怕這樣定量出來的data不準... 我把實驗的圖檔以下列連結分享 http://ppt.cc/3MhU 另外我也找了一篇也是用這個染劑來做吞噬實驗的paper 讓各位高手來對照他的圖來看我是否有地方沒注意到 paper如下 http://ppt.cc/bvU2 主要是裡面figure 4和6這兩張圖 麻煩各位高手指導 謝謝大家(跪~) --

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